丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体透皮制剂的制备及其抑瘢作用考察

发布时间：2020-09-15 10:40

　　研究背景增生性瘢痕(hypertrophic scars,HS)临床治疗手段主要有手术切除和药物治疗。手术治疗费用较高,且复发率高,而目前主要应用于临床抑制HS的药物,毒副作用大、复发率高。因此,研制出有效治疗防治瘢痕增生的药物是该领域的当务之急。贝伐单抗(Bevacizmnab,BEV)能特异性阻断VEGF的生物效应,抑制增生性瘢痕血管过度增生,抑制成纤维细胞(Fb)生长和转移,从而抑制瘢痕增生。丹皮酚能抑制转换因子-β_1(TGF-β_1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及细胞内氧自由基产生,能有效抑制微血管过度增殖。本课题拟将贝伐单抗通过聚乙二醇与磷脂相连,制备抗体修饰脂质体包裹丹皮酚,增强药物在真皮层的滞留量,阻断VEGF的生物效应,达到预防瘢痕增生的目的。目的研制丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体透皮制剂,优化处方和制备工艺,考察其体外透皮性能及真皮滞效应,并进行丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体透皮制剂皮肤刺激性及抑瘢效果考察。方法(1)BEV-PEG_(3000)-DOPE抗体偶联物合成。包括Pnp-PEG_(3000)-DOPE合成,MS进行结构鉴定;采用乙醇注入法合成BEV-PEG_(3000)-DOPE,Sephadex G-150凝胶柱法测定偶联率,GPC测定BEV-PEG_(3000)-DOPE分子量,IR进行结构鉴定。(2)丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体的制备及其质量考察。采用薄膜分散-超声法制备丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体,以包封率为评价指标,单因素试验筛选出显著因素,Box-Behnken响应面法优选丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体的制备工艺,透射电镜观察脂质体形态,激光粒度仪测定粒径及Zeta电位。制备丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体透皮制剂。(3)丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体透皮制剂的质量考察。考察丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体的质量性质,包括性状、粘度、pH值、离心试验及含量测定。进行真皮滞留量的考察,比较丹皮酚VEGF抗体脂质体透皮制剂、丹皮酚脂质体凝胶及丹皮酚凝胶中丹皮酚的真皮滞留量及透皮速率,并绘制体外渗透曲线。采用左右对比法进行皮肤刺激性考察,观察皮肤有无红斑及水肿现象,同时将给药部位的皮肤HE染色。(4)将兔子随机分为模型组、空白组、阳性药物组、丹皮酚凝胶组(Pae-Gel)、丹皮酚脂质体凝胶组(Pae-Lip-Gel)与丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体透皮制剂组(Bev-Pae-Lip-Gel),建立兔耳增生性瘢痕模型,计算各组瘢痕增生率,测量各组瘢痕增生指数(SEI),光镜下观察HE染色与Masson染色后组织增生情况,双抗体夹心酶联免疫吸附实验法(ELISA)检测各组VEGF、TGF-β_1与TNF-α表达水平。结果(1)成功合成Pnp-PEG_(3000)-DOPE,分子量为4090;成功合成BEV-PEG_(3000)-DOPE,偶联率为63.72%,分子量为226570,IR测得所需官能团。(2)丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体最优制备工艺为:卵磷脂:胆固醇:丹皮酚:Pnp-PEG_(3000)-DOPE:BEV-PEG_(3000)-DOPE为14:5:4:0.28:0.05,磷脂浓度7.36mg·mL~(-1),成膜温度为41℃,pH 7.5的磷酸二氢钠缓冲溶液脱膜,超声3 min(超声时间2 s,间隔3 s,功率300 W);包封率(73.61±2.36)%,平均粒径(235.7±4.67)nm,Zeta电位-(5.13±0.25)mV。(3)丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体透皮制剂粘度在6.6~7.4 Pa·S之间,pH值在7.0~7.5之间,含量为2.193±0.3107 mg·g~(-1);丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体透皮制剂透皮速率缓慢,真皮滞留效果显著。丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体凝胶无刺激性。(4)丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体透皮制剂组的瘢痕增生率为47.92%,低于其他各组;SEI为1.34±0.51,VEGF为30.90±3.57 ng·L~(-1),TGF-β_1为733.2±43.19ng·L~(-1),TNF-α为66.76±2.98 ng·L~(-1),与模型组差异具有统计学意义(P0.01)。与模型组比,丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体凝胶组胶原纤维细胞与肌纤维细胞较少,排列疏松,软骨细胞排列较规则,钙化不严重,炎症细胞较少。结论乙醇注入法适于制备BEV-PEG_(3000)-DOPE,Box-Behnken效应面法可用于优化丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体透皮制剂制备工艺,丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体透皮制剂具有缓释作用,真皮滞留量显著;丹皮酚VEGF抗体修饰脂质体透皮制剂对家兔皮肤无刺激性且对兔耳增生性瘢痕有良好的治疗效果。
【学位单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ460.6;R285
【部分图文】：

瘢痕形成,机制

图 1-1 瘢痕形成机制图Fig.1-1 The mechanisms of hypertrophic scar1.2治疗手段1.2.1压力疗法加压治疗主要是压力可以调节ECM中胶原含量，使之达到合成分解的平衡，并促使螺旋状胶原束恢复弹性，达到平行排列的状态[17]。已经有研究证实，加压治疗不仅可以改善 ECM 的组织结构，而且降低 Fb 的数量。该方法一般是在伤口愈合初期采取的治疗手段，愈合 6 个月以后，治疗效果明显降低。1.2.2激光疗法激光治疗自上世纪中叶被用于临床，通过激光物理特性，如烧灼、切割、散焦等作用，消除 HS 组织。这种方法可以减少 ECM 中胶原合成和 Fb 增殖，从而达到 HS 治疗的目的[18]。目前脉冲染料激光、Nd:YAG 激光、点阵激光、光动力

脂质体,丹皮酚,结构图,药物

一条可行性途径。将BEV修饰脂质体，明显抑制原生代培养血管内皮细胞中VEGF表达，防止肿瘤部位的新生血管生成。VEGF 抗体修饰脂质体工艺成熟、制备简单，易于工业化推广；但未见 BEV 结合脂质体包载丹皮酚应用于增生性瘢痕的治疗。我们设想，将 BEV 修饰脂质体表面，制备成靶向制剂，利用 BEV 的靶向作用，与 VEGF 受体相结合，将脂质体微粒牢牢的留于真皮层，同时释放包封药物，实现药物在瘢痕增生部位的定位滞留。我们推测，VEGF 抗体修饰脂质体载体可望同时发挥着定位定向传输药物及抑制血管增值和炎症反应的双重作用。4.2创新点抗体修饰脂质体由于其具备长循环链，可以避免贮存过程中易发生氧化、分层、泄漏等稳定性问题发生。将 BEV 修饰脂质体表面，制备成靶向制剂，利用 BEV 的靶向作用，与 VEGF受体相结合，将脂质体微粒滞留于真皮层，同时释放包封药物，实现药物在瘢痕增生部位的定位滞留，达到预防瘢痕增生的目的。

质谱图,三氯甲烷,溶液,药科大学

广东药科大学硕士研究论文方法与结果 Pnp-PEG3000-DOPE合成取 DOPE 32 μmol，加入适量三氯甲烷溶解，配置成 50 mg·mL-1溶液，胺80 μL，加入适量浓度为200 mg·mL-1PEG-(Pnp)2三氯甲烷溶液，氩气搅拌孵育过夜。减压蒸发，除去三氯甲烷，在 pH 为 2.0(HCl 溶液调节) 0.15 mol·L-1的 NaCl 溶液中，超声得到 Pnp-PEG3000-DOPE 胶束，用 Seph 20 柱分离纯化，三氯甲烷萃取 Pnp-PEG3000-DOPE(纯度>95%)，MS 进行定，结果见图 2-1 。结果表明合成物分子量为 4090 ，与目标产-PEG3000-DOPE 吻合。

【参考文献】