二仙汤抗衰老性骨质疏松症的药效作用及网络药理学研究

发布时间：2020-09-15 16:49

　　目的二仙汤由淫羊藿、仙茅、巴戟天、黄柏、当归、知母6味药材等比例合煎而得,目前广泛用于治疗骨质疏松症,本次实验研究二仙汤对衰老性骨质疏松骨微结构及行为的影响,明确其对氧化损伤成骨细胞的保护作用,以网络药理学技术分析二仙汤抗衰老性骨质疏松作用机制。方法以D-半乳糖(D-Gal)注射制备衰老性骨质疏松模型,观察二仙汤对衰老性骨质疏松大鼠血清生化指标的影响;通过Micro-CT检测骨密度和骨组织形态变化;使用Morris水迷宫测试方法进行定位航行及空间探索实验,分析每组大鼠间各项游泳数据的差异性;采用新生24h Wistar大鼠颅盖骨分离得到原代成骨细胞,观察二仙汤提取物及其有效成分对氧化损伤的成骨细胞的增殖(MTT)、活性氧簇(ROS)及凋亡的影响;并采用Western blot方法,观察二仙汤有效成分对氧化损伤的成骨细胞骨形成蛋白Runx2的影响;使用Cytoscape软件及靶标数据库预测二仙汤抗衰老性骨质疏松靶点,富集主要KEGG通路,以Western blot方法验证二仙汤对p-Akt、p-mTOR、Beclin1等关键靶点的调控作用。结果与空白组相比,模型组血清GSH-Px水平降低、MDA水平升高、ALP水平降低、DPD和IL6水平上调,骨密度明显降低,骨量丢失严重,定位航行潜伏期时间延长,空间探索能力降低;与模型组相比,给药组血清GSH-Px水平升高、MDA水平降低、ALP水平升高、DPD和IL6水平均降低,骨吸收速率降低,股骨骨密度增加,骨微结构得到显著改善,定位航行潜伏期时间缩短,空间探索能力显著提高;二仙汤水提物、醇提物及有效成分(阿魏酸、仙茅苷、淫羊藿苷、知母皂苷BⅡ、水晶兰苷、小檗碱)对氧化损伤成骨细胞模型的增殖活性有显著保护作用,同时降低氧化损伤成骨细胞ROS水平,提高细胞抗凋亡和抗氧化能力。且二仙汤有效成分(阿魏酸、仙茅苷、淫羊藿苷、知母皂苷BⅡ、水晶兰苷、小檗碱)具有提高氧化损伤成骨细胞Runx2蛋白表达量的作用;网络药理学分析结果显示二仙汤抗衰老性骨质疏松症靶点所涉及的生物过程与氧化应激通路相关,验证结果提示二仙汤药效成分可降低成骨细胞p-Akt、p-mTOR蛋白的表达,同时提高Beclin1的蛋白表达量,提示二仙汤可能通过抑制Akt/mTOR信号通路,使Akt和mTOR磷酸化水平减少,提高细胞自噬作用,抑制成骨细胞的氧化损伤。结论(1)二仙汤能够有效抑制衰老性骨质疏松大鼠体内氧化应激水平,提高骨密度,并增强衰老性大鼠的运动及学习能力。(2)二仙汤及其有效成分对氧化损伤成骨细胞的增殖作用、ROS水平、抗凋亡能力及Runx2的蛋白表达量均有显著改善作用。(3)网络药理学分析结果及实验验证表明,二仙汤抗衰老性骨质疏松的作用机制可能与调控Akt/mTOR信号通路,促进细胞自噬反应,提高成骨细胞的抗氧化和抗凋亡能力有关。
【学位单位】：内蒙古医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

二仙汤,血清,破骨细胞

12内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2019）应骨吸收状态[24]；而 IL-6 为前炎症细胞因子，是反映骨丢失的一个重要信号，具有促进破骨细胞活性及抑制破骨细胞凋亡的作用[25]。Micro-CT 可在微米级水平扫描高清的骨小梁结构，并精确计量标本骨参数，通过 Micro-CT 分析获得的骨组织形态计量学参数可以观测股骨骨密度变化，为骨组织提供了更为精准的全新测试方法[26-27]。二仙汤对衰老性骨质疏松大鼠 GSH-Px、MDA 活性的影响：如图 1-1-1 所示，与空白组相比，模型组大鼠血清中 GSH-Px 水平显著降低，MDA 水平显著升高；而给药组 Ale、EXD3、EXD6、EXD12 大鼠均能显著升高衰老性骨质疏松大鼠血清中 GSH-Px 水平、降低衰老性骨质疏松大鼠血清中的 MDA 水平。

骨质疏松症,二仙汤,大鼠,参数模型

仙汤对衰老性骨质疏松症大鼠血清中 ALP、DPD 及 IL6 的影（*P<0.05，**P<0.01 VS.CON，#P<0.05，##P<0.01VS.D-Gal衰老性骨质疏松症大鼠骨组织形态和骨计量参数模型组大鼠 ROI 区域较空白组明显空洞，骨小梁面积le、EXD3、EXD6、EXD12 可显著改善骨小梁的骨微骨质流失。

扫描图,大鼠,股骨,扫描图

##P<0.01VS.D-Gal）二仙汤对衰老性骨质疏松症大鼠骨组织形态和骨计量参数的影响：如图1-1-3 所示，模型组大鼠 ROI 区域较空白组明显空洞，骨小梁面积及数量显著减少；给药组 Ale、EXD3、EXD6、EXD12 可显著改善骨小梁的骨微结构，防止大鼠衰老导致的骨质流失。

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