目的通过中药汤剂长期口服来预防和治疗慢性关节疾病是传统中医独特的“不治已病治未病”治疗理论的一种具体体现,考虑膝关节骨性关节炎多因“本虚标实”诱因引起,于是在众多治疗骨性关节炎的方剂中选择独活寄生汤作为研究对象,以“固本培元祛邪”为治疗的理论依据,建立动物OA模型后,以独活寄生汤对实验动物进行干预。在造模后8周,对实验取出的软骨标本进行大致组织形态学观察,检测关节液中前列腺素2(PGE2)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的含量,检测OA软骨细胞中基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)的mRNA的表达,检测细胞外基质中的Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达等,探索独活寄生汤在预防和治疗OA过程中的主要作用靶点,为该方在预防和治疗OA提供相应的实验依据。方法将40只实验用新西兰大白兔随机分为5组,即A空白对照组、B模型组、C独活寄生汤低剂量组、D独活寄生汤中剂量组、E独活寄生汤高剂量组,每组各8只,除了空白对照组不做处理外,其他四组均采用改良伸直位石膏固定兔膝关节造模,造模后观察2天后,开始进行药物干预,独活寄生汤组浓缩液灌胃给药,每日一次;正常组和模型组给予生理盐水灌胃,每日一次。造模8周,末次给药后禁食12小时后,麻醉下空气栓塞处死实验动物。处死动物前,拍摄兔膝关节正侧位X片,在切开实验动物膝关节前抽取关节液。1采用双抗体夹心酶免疫吸附法(ELISA)测定动物模型关节液中的IL-1β、IL-6、PGE2、肿瘤坏死因子,并比较各组间差异。2切开实验动物膝关节,对实验兔子膝关节软骨进行大体观察并参照文献标准进行评分,并比较各组间差异。采用HE染色后光学显微镜下观察OA动物模型软骨组织形态,并比较各组间差异。3采用Realtime-PCR检测OA动物模型软骨细胞中MMP-3、TIMP-1的mRNA的表达,比较各组间差异。4采用免疫组化法结合免疫蛋白印记法(Western blot)检测OA动物模型软骨组织中蛋白多糖、II型胶原的影响,并比较各组间差异。结果1兔膝骨性关节炎模型建立后,肉眼观察可见空白组动物膝关节外观上无明显肿胀和畸形,膝关节切开后关节囊无明显增厚,关节滑膜形态正常无明显增生,关节软骨完整有弹性,无缺损区域;模型组关节外观肿胀明显,切开膝关节后见关节囊增厚,关节软骨颜色暗淡,软骨磨损较严重,表面有溃疡面形成,部分软骨表面出现缺损;低剂量组关节外观呈轻度肿胀,切开后关节囊略有增生,软骨表面略显粗糙,有微细裂纹产生,未见明显缺损,无溃疡面形成;中、高剂量组关节软骨表面较光滑,无明显软骨缺损和裂纹形成,表面无溃疡,滑膜无增生;空白组Mankin评分是最低的,相反模型组得出的评分最高,空白组和独活寄生汤低、中、高剂量组在与模型组比较时,显示它们之间的统计差异有显著性意义(P0.01)。2双抗体夹心酶免疫吸附法(ELISA)测定显示,干预后独活寄生汤低、中、高剂量组IL-1β、肿瘤坏死因子、IL-6、PGE2等炎症因子含量显著低于模型组,差异有明显统计学意义(P0.01),独活寄生汤中、高剂量组IL-1β、肿瘤坏死因子、IL-6、PGE2含量要低于独活寄生汤低剂量组,差距有显著统计学意义(P0.01);独活寄生汤中剂量组IL-1β、肿瘤坏死因子、IL-6、PGE2含量高于高剂量组,两者比较差别并无明显统计学意义(P0.05)。3 Realtime-PCR检测显示,经不同剂量独活寄生汤治疗后,可以降低OA动物模型软骨细胞中MMP-3的mRNA,而TIMP-1的mRNA表达较高,模型组关节软骨中的MMP-3的mRNA表达较高,而TIMP-1的mRNA表达明显降低,各组间比较有显著差异性(P0.01)。4干预后独活寄生汤组和模型组比较,独活寄生汤中、高剂量组中Ⅱ型胶原表达与模型组差异有显著统计学意义(P0.01);低剂量组与模型组比较无明显统计学意义(P0.05),中、高剂量组之间比较无显著统计学意义(P0.05);另外独活寄生汤中、高剂量组GAG含量显著高于模型组,差异有显著统计学意义(P0.01);低剂量组高于模型组,差异有统计学意义(P0.05);独活寄生汤中、高剂量组GAG含量要高于独活寄生汤低剂量组,差距有显著统计学意义(P0.01);独活寄生汤中剂量组GAG含量低于高剂量组,两者比较差别并无明显统计学意义(P0.05)。结论1用改良伸直型固定方式给实验动物兔子造模8周时间,可以建立兔膝OA模型。2不同剂量的独活寄生汤均可以降低关节液中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、前列腺素2(PGE2)等炎症因子的水平,独活寄生汤也可以增加金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)的mRNA表达,抑制基质金属蛋白酶-3(MMP-3)的mRNA表达,促进细胞外基质Ⅱ型胶原合成,延缓其降解速度,增加软骨基质中GAG含量,在针对兔膝骨性关节炎病变过程中能起到显著的治疗效果,对OA疾病有较好的预防性治疗作用。3独活寄生汤是以去除风寒湿邪为主,辅以补肝肾、益气血药物,在治疗膝KOA的过程中,方中诸位药物配伍应用,更甚单味药的治疗效果。动物实验也证明:独活寄生汤的治疗可以保护软骨防治兔膝OA。
【学位单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
伸直位石膏固定造模
造模后佩戴项圈驱赶活动
造模后B组X片
【参考文献】
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