不同炮制和煎煮时间大黄对慢性肾衰竭影响的实验研究

发布时间：2020-09-16 13:22

　　目的大黄治疗慢性肾衰竭(CRF)的疗效肯定,有生、熟、酒、炭四种炮制品。本研究旨在测定不同炮制和煎煮时间大黄的有效成分变化规律,建立CRF大鼠模型,通过不同炮制方法和煎煮时间的大黄水煎液灌胃治疗CRF大鼠,观察CRF大鼠肾功能改善情况,找出治疗CRF大鼠的最佳炮制方法及煎煮时间点,并探讨大黄治疗CRF的作用机理,为合理使用大黄治疗CRF提供理论依据。方法实验一:生大黄、熟大黄、酒大黄、大黄炭四种炮制品采用后下的方式,分别煎煮5,7,9,10,15,20,30分钟,制成浓度为1g/ml的大黄水煎液各50ml。四种大黄,每种7个不同煎煮时间点的样品。采用高效液相色谱法测定28种大黄水煎液中没食子酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚主要成分含量,并行线性关系考察,精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验。实验二:将160只SD大鼠随机选取10只作为正常对照组,其余150只随机分笼饲养,采用灌胃腺嘌呤溶液的方法制备慢性肾衰大鼠模型,浓度为2.5%,按200 mg·kg~(-1)·d~(-1),造模周期28天。观察模型大鼠的体重,肾功能,解剖病理结构,由此得到能真实模拟CRF疾病与症状表现,且死亡率低,具有较好重复性的CRF的造模方法,为后期实验提供依据。实验三:将145只CRF大鼠随机分为模型组,大黄水煎液治疗组(每种大黄炮制品后下分别煎煮5、7、9、10、15、20、30min),正常对照组,每组5只大鼠,共30组。正常组正常饲料喂养,模型组给予等剂量的大黄治疗组生理盐水灌胃,28组大黄治疗组,每日给相应的大黄水煎液灌胃,共治疗8周。检测治疗后各组大鼠血BUN、血Cr、血UA值,观察改善肾功能的情况。实验四:采用实验三方法,治疗观察实验大鼠一周时,四周时的首次泻下时间、5h内泻下次数和总排便次数,比较泻下作用,测定大鼠的结肠组织的ATP酶活力,比较治疗一周和四周时的各组大鼠肾功能指标,分析肾功能与泻下的关系。实验五:将80只CRF大鼠随机分为模型组,熟大黄水煎液治疗组(熟大黄后下分别煎煮5、7、9、10、15、20、30min),正常对照组,每组10只大鼠,共9组。正常组正常饲料喂养,模型组给予等剂量的熟大黄治疗组生理盐水灌胃,7组熟大黄治疗组,每日给相应的熟大黄水煎液灌胃,治疗8周。摘取肾脏,观察形态,右肾组织制备石蜡切片,左肾组织-80℃冰箱保存。制备大鼠肾脏病理切片,观察各组肾脏病理学改变,观察肾脏细胞凋亡情况。实验六:选取实验五各组大鼠肾组织石蜡切片,免疫组化法检测肾组织LN、ColⅣ、α-SMA、p-PI3k、PI3k、p-Akt、Akt、TGF-β1蛋白的表达。实验七:选取实验五各组大鼠新鲜冰冻肾组织,RT-PCR技术检测肾组织AQP1mRNA、AQP2mRNA、TGF-β1mRNA的表达水平。实验八:选取实验五各组大鼠新鲜冰冻肾组织,Western-blot技术检测熟大黄组对CRF大鼠LN、ColⅣ、α-SMA、p-PI3k、PI3k、p-Akt、Akt、TGF-β1蛋白的表达水平。结果(1)实验一,28种大黄水煎液中没食子酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量线性关系、稳定性、精密度、稳定性、重复性、加样回收率良好。4中炮制品随煎煮时间增加,除熟大黄之外,主要成分的含量均呈递增的趋势。熟大黄主要成分含量在10分钟左右达到最大值,蒽醌类主要成分在不同炮制品中总含量依次为生大黄熟大黄酒大黄大黄炭。(2)实验二,根据相关文献及预实验结果选用灌胃腺嘌呤溶液的方法制备CRF模型,可真实模拟CRF疾病与症状表现,且死亡率低,具有较好重复性。(3)实验三结果显示,治疗8周后,在生大黄、熟大黄、酒大黄、大黄炭组中,与模型组相比,血Cr、血BUN、血UA值显著降低(P0.01),其中生大黄9分钟降低最明显(P0.05),熟大黄、大黄炭10分钟降低最明显(P0.05),酒大黄15分钟降低最明显(P0.05);在四种大黄炮制组中,其中熟大黄组降低最明显(P0.05)。(4)实验四结果显示,治疗一周时,与正常组、模型组比较,大黄治疗组均有泻下作用(P0.01);生大黄10分钟组的泻下作用最明显(P0.05);大黄治疗组血Cr、血BUN、血UA值显著降低(P0.01);其中生大黄组降低最明显(P0.05)。治疗四周时,每组大黄泻下作用均不明显,几乎没有泻下作用,无法统计。四种大黄炮制组中,与模型组相比,大黄治疗组血Cr、血BUN、血UA值显著降低(P0.01);其中熟大黄组降低最明显,且有统计学意义(P0.05)各组大黄炮制品治疗组与正常组比较,均对大鼠结肠Na+-K+-ATP酶的活性有抑制作用(P0.01),其中生大黄组抑制作用最明显(P0.05)。(5)实验五结果显示,与模型组相比,熟大黄治疗组肾小球系膜/小球面积比值显著降低(P0.01),其中熟大黄10分钟降低最明显(P0.05);熟大黄治疗组细胞凋亡率显著降低(P0.01),其中熟大黄10分钟降低最明显(P0.05)。(6)实验六结果显示,模型组大鼠肾组织的LN、ColⅣ、α-SMA、TGF-β1、p-PI3k、PI3k、p-Akt、Akt平均光密度显著高于正常组(P0.01);而与模型组相比,熟大黄治疗组平均光密度比值显著降低(P0.01),其中熟大黄10分钟组降低最明显(P0.05)(7)实验七结果显示,正常组中AQP1mRNA、AQP2mRNA表达,较模型组比较明显增强(P㩳0.01),其中熟大黄10分钟组增强最明显。模型组大鼠肾组织的TGF-β1mRNA表达量显著高于正常组(P0.01);而与模型组相比,熟大黄治疗组表达量显著降低(P0.01)。其中熟大黄10分钟组降低最明显(P0.05)。(8)实验八结果显示,模型组大鼠肾组织的PI3k、Akt、LN、ColⅣ、α-SMA、TGF-β1平均灰度比值显著高于正常组(P0.01);而与模型组相比,熟大黄治疗组平均灰度比值显著降低(P0.01),其中熟大黄10分钟降低最明显(P0.05)。模型组大鼠肾组织的p-PI3k、p-Akt平均灰度比值显著低于正常组(P0.01);而与模型组相比,熟大黄治疗组平均灰度比值显著增高(P0.01),其中熟大黄10分钟增高最明显(P0.05)。结论(1)高效液相色谱法测定各大黄水煎液成分稳定精确,蒽醌类主要成分在不同炮制品中总含量依次为生大黄熟大黄酒大黄大黄炭,熟大黄主要成分在10分钟左右含量达到最大值。(2)CRF模型的建立,以浓度为2.5%,按200mg·kg~(-1)·d~(-1)灌胃腺嘌呤溶液的方法制备CRF大鼠模型,最为稳定,死亡率低。(3)熟大黄后下煎煮10分钟组,对CRF大鼠肾功能改善最明显,熟大黄后下煎煮10分钟治疗CRF大鼠疗效最佳,优于其它煎煮时间的炮制品。(4)大黄治疗CRF的机理与其泻下作用有一定关系,生大黄泻下作用强于其它炮制大黄,生大黄在早期肾功能指标的恢复中有一定的优势,在后期治疗中以熟大黄为优。(5)熟大黄治疗CRF大鼠,通过抑制肾小球系膜增生,抑制细胞凋亡,减轻肾小球硬化程度,延缓CRF进程。(6)熟大黄治疗CRF大鼠,通过对AQP1、AQP2的调节,减少水分的滞留及毒素的蓄积,同时通过对TGF-β1mRNA的抑制作用,减轻肾小球硬化的程度,从而延缓肾功能的进展。(7)熟大黄治疗CRF大鼠,可能通过抑制p-PI3k、p-Akt,从而抑制TGF-β1/PI3k/Akt通路,达到减轻CRF大鼠肾组织纤维化的作用。(8)通过上述7点,我们认为,大黄能有效改善CRF大鼠肾功能及肾脏纤维化。在大黄炮制品中,后下煎煮时间10min左右的熟大黄更适用于CRF大鼠的治疗。我们探讨了其可能的作用机制,为大黄更好的治疗CRF提供了理论依据。
【学位单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

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湖北中医药大学 2019 届博士学位论文造模后两组血清肌酐、尿素氮和尿酸水平的比较（ x±s，n=10体重血 CR 血 BUN 血 UA350.12±12.56 86.09±5.26 5.20±1.22 132.08±20.300.52±9.25*122.20±18.36*8.27±2.56*241.51±32.1对照组比较，*P<0.01。剖形态学比较物实验结束时，用 10%水合氯醛麻醉 SD 大鼠。测量肾脏的外观，肾脏的组织病理学变化。结果显示，正常对照，红褐色，表面光滑，形态正常，切面观察肾皮髓质分RF 大鼠肾脏肥大，面色苍白，表面凹凸不平，表现为质与髓质之间的界限不明显。见图 4。

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