中药一口钟的抗炎活性成分研究

发布时间：2020-09-17 13:45

　　一口钟是桃金娘科(Myrtaceae)桉属植物中蓝桉(Eucalyptus globulus Labill.)的成熟干燥果实,果形犹如倒挂的小钟而得名。一口钟是我国传统的民间中草药,主产于西南地区,具有抑菌消炎、补脾健胃、通络祛风利湿等功效。截至目前为止,文献报道一口钟包含的化学成分有单萜、倍半萜、间苯三酚类、黄酮类、三萜类及鞣花酸类等。前期研究发现一口钟甲醇提取物能抑制小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 NO和TNF-α的产生,还对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocyte,FLS)的增殖与TNF-α的分泌有抑制作用,本文以探索中药中结构新颖、抗炎作用突出的活性化合物为目的,选取了一口钟为对象进行研究:(1)对一口钟进行化学成分的分离与鉴定;(2)对所得化合物进行抗炎和抗类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)活性筛选。本文以95%乙醇作为提取溶剂、以石油醚等有机溶剂作为萃取剂,依次得到石油醚、醋酸乙酯和水层萃取物,之后以硅胶柱色谱、凝胶渗透色谱和半制备高效液相色谱(Semi-high performance liquid chromatography,HPLC)等色谱分离技术分离纯化样品,先后从一口钟95%乙醇提取物的石油醚层萃取部位得到27个化合物,通过质谱(Mass spectrometry,MS)、一维和二维核磁共振波谱(1D,2D-Nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)等技术,解析鉴定出每个化合物的结构,分别为:globulol A(1),globulol B(2),globulol C(3),eucalyptal A(4),eucalyptone(5),euglobal-Ia1(6),euglobal-Ia2(7),euglobal-Ⅲ(8),macrocarpal A(9),macrocarpal B(10),macrocarpal C(11),macrocarpal D(12),macrocarpal E(13),macrocarpal P(14),macrocarpal Q(15),1,10-dioxotayloriane(16),litseagermacrane(17),蓝桉醇(18),表蓝桉醇(19),绿花白千层醇(20),齐墩果酸(21),白桦脂酸(22),熊果酸(23),11α-甲氧基熊果酸(24),1-(2,6-dihydroxy-4-methory-3,5-dimethylphenyl)-2-methylbutan-1-one(25),鞣花酸(26),3-甲氧基鞣花酸-4'-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(27)。其中化合物1~3为未见文献报道的新化合物,化合物16和17为首次从桉属植物中分离得到,化合物14、15、24和25为首次从蓝桉植物分离得到,化合物5、6、7、8、11、12和13为首次从蓝桉的果实中分离得到。本文选用小鼠单核巨噬细胞RAW264.7为细胞模型,对部分化合物进行了抗NO释放活性和TNF-α抑制分泌活性的筛选。在低细胞毒剂量下,利用Griess法,考察化合物对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激RAW264.7细胞释放NO的抑制作用。结果表明,化合物9、13、15和19在1μg/mL时有较强的抑制活性,抑制率分别为:20.39%、12.25%、15.07%和12.66%;以酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检验化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α的抑制活性,化合物9、10、15、18、19、20、22和25在1μg/m L浓度下显示出较强的抑制活性,抑制率分别为:27.30%、31.58%、27.70%、23.73%、30.08%、36.46%、31.39%和21.21%。本文以类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)为细胞模型,进行细胞增殖抑制实验和抑制TNF-α生成实验的研究,结果显示化合物2、5、9、10、13和22在5μg/mL时能干扰FLS细胞的正常生长,FLS细胞生长抑制率分别为:73.91%、33.78%、37.50%、25.40%、34.23%和67.21%;在筛选化合物对于TNF-α生成的抑制活性时,采用抗原抗体反应结合酶联免疫的方法进行测试,结果显示化合物2、5、9、10、11和13在1μg/mL时对TNF-α生成的抑制率分别为44.56%、59.31%、25.43%、29.66%、55.09%和54.72%,表现出一定的抑制作用。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R284.1
【部分图文】：

过程图,提取物,过程,萃取物

类型规格流动相相柱YMC-Pack ODS-A SH-343-520 mm×250 mmAA12S05-2520WTNo.2025001996 (W)MeOH-H2O 一口钟提取分离过程1 一口钟样品的粗提物分离一口钟药材（干重 20 kg）粉碎，95%乙醇浸渍，每次浸渍 3 天，，将浸渍液合并后减压浓缩，得到乙醇提取物的浸膏(2992 g)。乙次经过石油醚、醋酸乙酯和水萃取 3 次，分别得到不同有机溶剂层合并相同溶剂的萃取物进行减压浓缩，最终得到石油醚萃取物(1592萃取物(406 g)和水层萃取物。石油醚层萃取物 800 g，经硅胶柱色谱初步分离，流动相选择石油酯(60:1, 30:1, 15:1, 8:1, 4:1, 2:1, 1:1)梯度洗脱，得到Y0101-Y0116，共具体分离过程见图 1.1。

高效液相色谱,分离过程,组分,半制备

医科大学硕士学位论文一、中药一口钟化学成分的提取分离与鉴石油醚、乙酸乙酯、水萃取 3 次，合并萃取液，减压浓缩硅胶柱色谱，石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱.2 一口钟样品的系统分离Y0114 (59 g)组分，进行硅胶(200-300 目)柱分离，流动相是二氯甲烷：甲醇(CH2Cl2:MeOH:CH3COOH = 80:1:1)，得到 14 个组分，其中 0204 和 0207 化合物 9 (26.0 mg)，10 (42.5 mg)。Y0203 (9 g)通过半制备高效液相色C)反相柱分离，以甲醇：水(MeOH:H2O = 90:10)和 5‰冰乙酸(5‰CH3COO动相，得到化合物 1 (4.5 mg)，12 (5.2 mg)，13 (34.8 mg)。Y0205 和Y02合并后，经半制备高效液相色谱反相柱分离，以MeOH:H2O = 90:10H3COOH为流动相，得到化合物 17 (4.2 mg)，组分Y1208 和Y1219 分别用HPLC纯化，依次得到化合3 (4.6 mg)，4 (35.8 mg)，5 (264.3 mg)，14 (11.5 mg2.6 mg)，16 (2.7 mg)，27 (5.0 mg)。具体分离过程见图 1.2 所示。

分离过程,组分,半制备,化合物

天津医科大学硕士学位论文一、中药一口钟化学成分的提取分离与鉴定组分Y0115 经Toyopearl HW-40 凝胶柱色谱分离，流动相为二氯甲烷：甲醇(CH2Cl2:MeOH = 2:1)，得到 6 个组分，其中组分Y0301 经硅胶柱色谱，以石油醚：二氯甲烷：乙酸乙酯：乙酸(P.E.:CH2Cl2:EtOAc:CH3COOH = 80:60:2:2)作为流动相进行分离，得到化合物 6 (27.5 mg)，7 (17.4 mg)，8 (5.3 mg)。组分Y0302经半制备HPLC (ODS-A, MeOH:H2O = 88:12, 5‰CH3COOH)分离，得到化合物 2(23 mg)。组分Y0303 经半制备HPLC (ODS-A, MeOH:H2O = 93:7, 5‰CH3COOH)分离，分别得到化合物 11 (6.7 mg)，18 (22.1 mg)，21 (24 mg)，23 (19.1 mg)。组分Y0304 通过半制备HPLC (ODS-A, MeOH:H2O = 88:12, 5‰CH3COOH)纯化分离，依次得到化合物 19 (4.3 mg)，26 (13.3 mg)。组分Y0305 经过半制备HPLC(ODS-A, MeOH:H2O = 90:10, 5‰CH3COOH)纯化分离，得到化合物 20 (82.4 mg)，22 (10.5 mg)，24 (15.2 mg)，25 (3.3 mg)。分离流程如图 1.3 所示。

【参考文献】