细辛调节TRPV1离子通道镇痛机制研究

发布时间：2020-09-17 19:24

　　 疼痛是一种不适的感觉和情绪体验,伴随潜在的或实际性的组织损伤,疼痛持续或间歇性地持续3个月以上则定义为慢性疼痛。慢性疼痛尤其是神经病理性疼痛病程长,容易诱发各种并发症;此外,患者较易患失眠、焦虑、抑郁等亚健康问题,严重影响生活质量。然而,目前治疗慢性疼痛的药物多数存在不同程度的副反应,超过半数患者对药物的镇痛效果不满。细辛始载于东汉末年《神农本草经》,为临床常用中药,广泛用于治疗头痛,齿痛、鼻渊、三叉神经痛以及风湿痹痛等。研究报道,细辛挥发油类成分、水煎剂均具有较好的镇痛作用。瞬时感受器电位香草酸受体1(Transient Receptor Potential Vanilloid 1,TRPV1),作为TRP家族中的一员,被定义为疼痛门控分子,是治疗慢性疼痛的有效靶点之一,在神经病理性疼痛发生、发展过程中扮演重要角色。为了进一步评价细辛的镇痛作用,本文通过多种急慢性疼痛行为对细辛水提液和指标性成分细辛脂素(Asarinin)的镇痛活性开展了系统评价,并建立小鼠神经病理性疼痛模型(chronic constriction injury,CCI),基于TRPV1的表达与功能变化探讨了细辛镇痛机制。目的:多种急慢性疼痛模型评价细辛水提液和细辛脂素的镇痛活性;基于TRPV1的表达与功能,在神经病理性疼痛模型水平研究细辛水提液的镇痛机制。方法:(1)浸尾实验评价细辛水提液对伤害性热刺激引起疼痛行为的影响,确定最佳镇痛时间和浓度。随机选取6-8周大小的雄性C57BL/6小鼠,每组8只,细辛水提液(32 mg/kg)灌胃处理,记录灌胃后0、1、2、3、4、5h的48℃水浴浸尾实验甩尾时间,确定最佳镇痛时间。分别灌胃给予5.3mg/kg、32mg/kg、192 mg/kg细辛水提液,并记录灌胃2h后浸尾实验甩尾时间,确定最佳镇痛浓度。(2)热辐照和VonFrey实验评价细辛水提液对伤害性热刺激和机械刺激引起疼痛行为的影响。将16只小鼠随机分为对照组和WA组(32mg/kg),分别给予纯水和WA灌胃2h后,测量小鼠机械缩足阈值(MWT)和热缩足反射潜伏期(TWL)。(3)评价细辛水提液对辣椒素、甲醛刺激引起的疼痛行为的影响。辣椒素急性致痛实验:对照组(纯水灌胃)、WA组(32mg/kg);1%福尔马林致痛实验:对照组(纯水灌胃)、WA组(32mg/kg),每组随机选取6只雄性小鼠。灌胃2h后在小鼠右脚掌分别注射辣椒素(500μM/10μL/mouse)和1%的福尔马林(1OμL/mouse),注射辣椒素组录像30min,福尔马林组1h,并统计小鼠抬脚的次数和舔脚时间。(4)评价细辛水提液对神经病理性疼痛引起的痛觉敏化的影响。随机分组,每组13只雄性小鼠,共6组。分别为:空白组、假手术组、坐骨神经慢性压迫模型组(CCI)、细辛水提液低剂量组(WA-L)、细辛水提液高剂量组(WA-H)、加巴喷丁组(GBPT)。CCI模型建立5天观察到明显疼痛行为后开始给予药物灌胃处理:空白组和假手术组以及CCI组给予纯水;WA-L组:32mg/kg/day细辛水提液灌胃;WA-H组:96mg/kg/day细辛水提液灌胃;GBPT组:0.2 g/kg/day加巴喷丁灌胃,每天给药一次,持续给药9天。测量6组小鼠的体重,并于第0、1、3、5、7、9、11、13天测得机械缩足阈值和热缩足反射潜伏期。(5)基于TRPV1的功能与表达活性,探索细辛水提液抑制神经病理性疼痛引起的痛觉敏化的机制。第14天灌胃2h后取小鼠L4-L6及骶部的DRG,借助钙离子成像技术观察各组小鼠DRG神经元TRPV1生理活性的变化。取小鼠腰L4-L6及骶部的DRG,借助免疫荧光染色、实时荧光定量-聚合酶链式反应观察各组小鼠TRPV1表达活性变化。(6)细辛脂素是细辛的指标性化学成分,探讨细辛脂素对伤害性热刺激和伤害性机械刺激引起疼痛行为的影响。每组6只雄性小鼠,分为对照组和Asarinin-L组(0.8mg/kg)、Asarinin-M组(2.5mg/kg)和Asarinin-H组(7.5mg/kg),小鼠右侧脚掌皮下注射Asarinin(10μL/mouse)30min后,测量MWT和TWL。(7)评价细辛脂素对炎性痛诱导的痛觉敏化的影响。分为对照组(Saline+1%乙醇)、Asarinin-L组(8mg/kg)、Asarinin-M组(25mg/kg)和Asarinin-H组(75mg/kg),每组8只小鼠。完全弗氏佐剂(CFA)诱导的炎性痛模型第2天分别灌胃给药,选取0.4g、0.07g的力度刺激小鼠右侧脚掌10次,统计给药1h、2h后每个力度刺激下小鼠抬脚的比例,并测量TWL。结果:(1)细辛水提液灌胃后可抑制伤害性热刺激引起的疼痛长达5h,并在给药2h后镇痛效果最佳。细辛水提液抑制伤害性热刺激引起的疼痛具有剂量依赖性,32mg/kg的浓度下镇痛效果可达到最佳。(2)热辐照和VonFrey实验表明:细辛水提液明显抑制伤害性热刺激和机械刺激引起的疼痛行为。(3)辣椒素致痛实验和福尔马林致痛实验显示:给予WA处理的小鼠,对于辣椒素引起的疼痛行为有抑制作用,不论是舔脚的次数还是时间都明显下降;对福尔马林所致的疼痛无明显抑制作用。(4)CCI模型建立中,小鼠的机械缩足阈值和热缩足反射潜伏期结果显示,从术后第3天开始下降,第5天达到最低值;而当第5天开始给药处理后,实验第7天开始机械缩足阈值和热缩足反射潜伏期均缓慢回升,于第9天达到顶峰,并在第9-13天阈值保持基本稳定,进入平台期。第13天的实验统计结果显示:naive组和sham组基本保持一致,无差异;CCI组各阈值则显著下降(P0.001);WA-L组、WA-H组、GBPT组,机械缩足阈值(MWT)和热缩足反射潜伏期(TWL)都显著升高,与CCI组相比,差异明显(P0.001)。且WA-L在灌胃2h时阈值最高,镇痛效果最为明显,6h仍与CCI组有明显差异,说明WA镇痛药效可达6h,甚至以上。(5)钙成像实验结果显示:WA-L(6.4μg/mL)和WA-H(64μg/mL)均有效抑制了TRPV1激动剂辣椒素(capsaicin)引起的钙离子内流(P0.01或P0.001)。钙成像实验结果显示:CCI模型建立后,DRG神经元对TRPV1激动剂辣椒素的反应比例明显增加(P0.05);而给药处理后,WA-H组、GBPT组DRG神经元对辣椒素反应的比例则显著下降(P0.05或P0.001),WA-L组虽没有显著性差异,但有下降的趋势。(6)免疫荧光染色实验表明:CCI造模后明显增加了TRPV1+神经元的比例(P0.05);而不论是WA-L组、WA-H组,又或是GBPT组,均显著减少了TRPV1+神经元的比例(P0.05或P0.001)。(7)实时定量PCR实验结果显示:与免疫荧光染色结果相一致,CCI组增加了TRPV1的表达(P0.05),而WA-L组、WA-H组、GBPT组显著下调了TRPV1的表达(P0.05或P0.001或P0.01)。(8)细辛脂素有效抑制伤害性热刺激和机械刺激引起的疼痛行为,2.5mg/kg浓度可达最佳镇痛效果。(9)完全弗氏佐剂诱导的慢性炎性痛模型中,小鼠的TWL在造模第2天明显下降,而当给药处理后1h后,各组TWL呈上升趋势,且2h后Asarinin-M组(25mg/kg)镇痛效果最好(p0.01)。Vonfrey实验结果显示:0.4g、0.07g的力度刺激下,造模第2天各组小鼠抬脚的频率明显上升,给药处理后,1h后抬脚频率逐渐下降,2h后达到最低(P0.05或P0.001或P0.01)。结论:细辛水提液及其指标性成分细辛脂素对多种急慢性疼痛通均具有显著的镇痛疗效,细辛水提液通过调节TRPV1的表达和活性抑制CCI诱导的疼痛行为。
【学位单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

图２－ｌ邋ＵＨＰＬＣ－ＴＱ／ＭＳ的方法鉴定主要化合物逡逑图丨：采用ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦ／ＭＳ／ＭＳ方法分析了细辛的主要成分。（Ａ－Ｃ）通过比较ｔＲ、＞ｔｍａｘ和ｗ邋ｚ与标准逡逑化合物的特点，采用ＬＣ－ＭＳ法从光谱中鉴定了去甲乌药碱和ｃａｕｌｅｓｎａｒｉｎｓｉｄｃ。逡逑．

为时间较短（６．５４±０．３９ｓ），而灌胃给予ＷＡ后以时间依赖的方式显著延迟了甩尾行为的时逡逑间。与对照组相比，ＷＡ邋（３２ｍｇ／ｋｇ）抑制有害热刺激引起的疼痛长达５ｈ，并且在给药２ｈ后逡逑显示出最佳的镇痛效果（］４．４１±0．４４，邋ｐ＜０．００１）（图２Ａ）。根据甩尾实验结果，在处理２ｈ后逡逑比较不同浓度ＷＡ邋（５．３ｍｇ／ｋｇ，３２ｍｇ／ｋｇ，丨９２ｍｇ／ｋｇ）的镇痛作用。如图２Ｂ所示，ＷＡ以剂逡逑量依赖性方式显示镇痛作用，ＷＡ在以３２ｍｇ／ｋｇ的浓度下显示出最佳的镇痛作用。因此，逡逑我们最终选择了邋３２ｍｇ／ｋｇ浓度的ＷＡ治疗２ｈ后测量随后的行为实验。为了进一步确定细逡逑辛水提液抗伤害感受的功效，通过机械缩足反射阈值（ＭＷＴ）和热缩足反射潜伏期（ＴＷＬ）逡逑测定评价了邋ＷＡ的镇痛作用。实验表明，ＷＡ显著减轻了伤害性热刺激和机械刺激引起的逡逑反应。ＴＷＬ邋从邋５．５３±０．５２邋增加到邋ｎ．９２±０．６８邋（ｐ＜０．0０0，邋ＭＷＴ邋也从邋１．０７士０．１３邋显着增加到逡逑１．５１±０．１４邋（ｐ＜０．０５）（图邋２Ｃ邋和邋Ｄ）。逡逑ａ邋２0ｉ逦ｒ邋２．０－１逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ逦ＷＡ逡逑＾邋＊逡逑＊＊＊逡逑ｓ＾１５－逦ｉｓ－邋Ｈ－逡逑逦逦逦逦逦＂＊＊逦＊逦逦１逦０．５－逡逑ｊ逦Ｔｉｍｅ（ｈ）逦ｊ逡逑０逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦0．0■邋■邋ｉ邋

逡逑图２：邋ＷＡ在４８°Ｃ水浴浸尾实验、热刺激和机械刺激中的抗伤害作用。（Ａ）４８°Ｃ水浴浸尾实验的抗伤害逡逑作用。观察ＷＡ治疗后的甩尾潜伏期，ＷＡ治疗２ｈ后镇痛效果最佳（ｎ＝８）。（Ｂ）ＷＡ表现出剂量依赖性逡逑的抗伤害作用（ｎ＝８）。（Ｃ）邋ＷＡ处理２小时后测定ＭＷＴ邋（３２ｍｇ／ｋｇ，邋ｎ＝８）。（Ｄ）治疗后２ｈ测定ＴＷＬ逡逑（３２ｍｇ／ｋｇ，ｎ＝８）邋（＊ｐ＜０．０５，邋＂ｐｃＯ．Ｏｌ，＊＊＊ｐ＜０．００１）。逡逑２．４讨论逡逑热痛是日常生活中典型的疼痛形式，浸尾实验和热辐射实验是最为常见的急性疼痛实逡逑验。？１１１＾出等［１１５］采用升温热板试验和升温水浴试验测量大鼠热痛阈值。上述结果显示，给逡逑予ＷＡ灌胃处理后，从ｌｈ开始，小鼠热痛阈值逐渐升高，２ｈ达到峰值，并能持续５ｈ。显逡逑然，ＷＡ能缓解热刺激诱导的疼痛行为；并且，机械刺激也进一步说明了邋ＷＡ能缓解伤害逡逑性机械刺激诱导的疼痛反应。所以

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本文编号：2821125