南蛇藤提取物靶向mTOR抑制肝癌的作用及机制研究

发布时间：2020-09-17 21:42

　　原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是严重影响人类健康的恶性肿瘤之一,发病率全球第五,肿瘤相关死亡率位于世界第三位,早期临床治疗常以手术切除为主,不能手术切除者,常采用经肝动脉插管栓塞化疗(TACE)。由于肝癌的早期临床症状不典型,诊断率低,且肝癌细胞侵袭力强,复发转移率高,往往患者的预后较差。中草药南蛇藤(Celastrus orbiculstus Thunb.),是卫矛科(Celastraceae)南蛇藤属(Celastrus L.)植物,作为我国重要的药用植物,药典上记载其有活血、解毒、祛风、消肿等功效。本课题组前期研究发现,南蛇藤乙酸乙酷提取物(Celastrbiculatus extracts,COE)能显著抑制肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR),属于磷脂憸肌醇激酶相关激酶蛋白家族成员,在细胞增殖、迁移和血管生成等方面有着中心调节作用。与正常组织相比,肝癌细胞中mTOR的表达水平明显增加,可作为肝癌治疗潜在的生物学靶点之一。为了深入探索南蛇藤提取物靶向mTOR治疗肝癌的作用,本研究利用RNAi技术,构建了消减表达mTOR的人肝癌HepG2细胞(记作:HepG2/mTOR-),并通过体内外研究,初步阐明了南蛇藤提取物对抑制肝癌的作用及分子机制。本研究内容分以下四个部分。第一部分构建人肝癌HepG2/mTOR-细胞株目的:构建稳定消减表达mTOR蛋白的人肝癌HepG2细胞株。方法:体外培养人肝癌HepG2细胞株至对数期,将GV248-mTOR RNAi慢病毒感染人肝癌HepG2细胞,设空载体对照组及野生型细胞对照组。24 h后,倒置荧光显微镜下观察细胞形态变化以及荧光表达情况。并分别提取细胞总蛋白和总RNA,分别利用Western blot方法和RT-qPCR法检测人肝癌HepG2细胞中mTOR蛋白和RNA的相对表达情况。结果:慢病毒转染人肝癌HepG2细胞24 h后,荧光显微镜下可见,野生对照细胞贴壁良好,多为梭状,折光性良好,细胞边缘清晰,核质均匀。与之相比,HepG2/mTOR-细胞形态未见明显变化,少数细胞变细长。HepG2/mTOR-细胞中GFP荧光表达强,占总细胞数目90%左右,感染效率高。RT-qPCR及Western blot检测结果显示,与野生组细胞相比,HepG2/mTOR-细胞中mTOR的RNA及蛋白的表达水平明显降低(P0.05)。结论:稳定消减表达mTOR的人肝癌HepG2细胞株构建成功。第二部分南蛇藤提取物对人肝癌HepG2/mTOR-细胞的影响目的:研究南蛇藤提取物(Celestrus Orbiculatus extracts,COE)对人肝癌HepG2/mTOR-细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移能力的影响。方法:取对数期生长的人肝癌HepG2/mTOR-细胞,加入不同浓度的COE(20,40,80,160,320mg/L),以不加药组细胞为对照,顺铂(DDP2mg/L)为阳性对照,MTT法检测各组药物对人肝癌HepG2/mTOR-细胞增殖能力的影响,并计算出IC50值;透射电镜观察药物处理后细胞的超微结构;利用流式细胞术检测COE对人肝癌HepG2/mTOR-细胞凋亡的影响;通过Transwell实验观察药物对细胞侵袭迁移的变化。结果:与野生型细胞比较,HepG2/mTOR-组细胞的增殖、侵袭及迁移能力减弱,促进增加。与未加药组相比,COE能促进HepG2/mTOR-细胞发生凋亡,抑制细胞的增殖、侵袭和迁移,并呈一定的浓度依赖性(P0.05)。结论:mTOR的表达与肝瘤细胞恶性程度正相关。COE能抑制人肝癌HepG2/mTOR-细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进肝瘤细胞的凋亡。第三部分南蛇藤提取物促进人肝癌HepG2/mTOR-凋亡的分子机制目的:研究南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatus exexact,COE)对肝癌HepG2/mTOR-细胞凋亡相关蛋白及PI3K/AKT相关信号通路的影响,并初步研究其可能分子机制。方法:取对数期生长的人肝癌HepG2/mTOR-细胞,依据IC50的结果,排除药物的细胞毒性作用干扰,加入不同浓度COE(40,80,120 mg/L),同时设立野生对照组、不加药对照组和阳性药物对照组(DDP 2 mg/L)。药物作用24 h后,提取总蛋白,利用Western blot法检测各组目的蛋白的表达量。结果:COE能下调凋亡抑制蛋白Bcl-2、Bcl-XL的表达,同时上调促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达,并具有浓度依赖性。COE抑制人肝癌HepG2/mTOR-细胞中mTOR信号通路相关蛋白p-PI3K、p-AKT、p-P70和P70、p-4E-BPl和4E-BPI的表达,并具有浓度依赖性(P0.05)。结论:COE促进人肝癌HepG2/mTOR-细胞发生凋亡,其作用机制与激活Bcl-2家族介导的信号通路有关,也可能同时激活PI3K/AKT相关信号通路有关。第四部分南蛇藤提取物抑制肝癌的体内研究目的:探讨南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatusextracts,COE)对裸鼠皮下移植瘤生长的影响。方法:将HepG2/mTOR-细胞用0.9%生理盐水悬浮密度至1×1O7个/mL,取200μL接种于裸鼠右侧皮下。待裸鼠皮下成瘤后,将裸鼠随机分为6组,每组6只,分别设对照组、COE低、中、高剂量组(10,20,40mg/kg)、阳性药物组(斑蝥胶囊195mg/kg,替吉奥1Omg/kg)。每日灌胃,每三日测量鼠重、瘤径,28天后颈椎脱臼法处死裸鼠,剥离皮下移植瘤并拍照,称量瘤重,并使用免疫组化方法检测实体瘤中相关蛋白表达。结果:COE显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长,并在一定范围内呈剂量依赖性。免疫组化结果表明,COE能够下调裸鼠皮下移植瘤内凋亡相关蛋白Bc1-2的表达,同时上调Bax、Caspase-3 的表达(P0.05)。结论:COE能够在体内抑制肝癌的生长。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

荧光显微镜,荧光,细胞的,野生型细胞

３．１人肝癌ＨｅｐＧ２／ｍＴＯＲ？细胞株的成功建立逡逑利用慢病毒载体，将ＧＶ２４８－ｍＴＯＲＲＮＡｉ－ＥＧＦＰ转染至肝癌ＨｅｐＧ２细胞中，并设立逡逑野生型细胞对照组及空载体阳性对照组，转染４８ｈ后，结果如图１－１所示，倒置荧光显微逡逑镜下观察，野生型细胞组和空载体阳性对照组细胞状态良好，细胞清晰，多为梭状形结构，逡逑细胞边缘光滑无突起，核质均匀。与野生型细胞形态相比，大部分ＨｅｐＧ２／ｍＴＯＲ；细胞形逡逑态无显著差异，ＧＦＰ荧光表达强，感染效率约９０％。逡逑Ｂｒｉｇｈｔ－ｆｉｃｌｄ邋Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ逦Ｍｅｒｇｅ逡逑＿＿邋■画逡逑图１－１荧光显微镜下观察ＨｅｐＧ２／ｍＴＯＲ＿细胞的荧光表达（１０0ｘ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋ｔｈｅ邋ｇｒｅｅｎ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｏｂｓｅｒｖｅｄ邋ｃｌｅａｒｌｙ邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ邋ｉｎ逡逑ＨｅｐＧ２／ｍＴＯＲ－邋ｃｅｌｌｓ邋（１０0ｘ）．逡逑

肝癌,细胞凋亡,细胞,人肝癌

逦ＣＯＥ（１２０ｍｇ／Ｌ）逦ＤＤＰ（２ｍｇ／Ｌ）逡逑图２－２邋ＣＯＥ对人肝癌ＨｅｐＧ２／ｍＴ０Ｒ＿细胞超微结构的影响逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２．邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＣＯＥ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｉｎ邋ＨｅｐＧ２／邋ｍＴＯＲ＇邋ｃｅｌｌｓ逡逑ｂｙ邋ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ邋ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．逡逑３．３南蛇藤提取物促进人肝癌ＨｅｐＧ２／ｍＴ０Ｒｚ细胞调亡逡逑Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ－ＰＥ染料与磷酯酰丝氨酸亲和力较强，能够结合早期凋亡的细胞外侧暴露的逡逑磷酯酰丝氨酸，７－ＡＡＤ染料是一种核酸染料，不可通过正常的细胞包膜，但是细胞发生凋逡逑亡时的细胞包膜发生破坏时，通透性增加，７－ＡＡＤ染料即可结合ＤＮＡ的有控降解。用流逡逑式细胞仪检测结果如图２－３所示，左下象限表示正常细胞，右下象限表示早期凋亡细胞，逡逑右上象限为晚期凋亡细胞。左上象限为死亡细胞及细胞碎片。ＨｅｐＧ２／ｍＴ０Ｒ＿细胞组与野逡逑生组细胞对比未见明显差异（Ｐ＞0．0５）。但随着ＣＯＥ浓度的增高，ＨｅｐＧ２／ｍＴ０Ｒ？细胞凋逡逑亡率逐渐上升，呈现一定的浓度依赖性（Ｐ＜０．０５）。结果表明，在一定范围内，ＣＯＥ呈浓逡逑度依赖性的促进人肝癌ＨｅｐＧ２／ｍＴＯＲ？细胞发生凋亡。逡逑