益气活血方通过调节Hippo-YAP1通路抑制肝纤维化的机制研究

发布时间：2020-09-19 08:58

　　目的:肝纤维化是由于病毒感染、药物、酒精等多种病因所导致的慢性肝炎的共同病理改变,主要表现为肝脏细胞外基质异常增生与过度沉积,关键在于肝星状细胞的活化。肝纤维化进行性加重,将进展为肝硬化,甚至肝癌。目前临床仍缺乏有效的抗肝纤维化的药物。我们前期针对肝纤维化的动物研究发现,自拟益气活血方对肝纤维化治疗疗效明确,但机制仍有待进一步探索。近来,多项研究显示Hippo-YAP1通路的失调与肝纤维化存在直接的关系。因此,本研究通过动物实验探讨益气活血方调控Hippo-YAP1通路的关键因子抗肝纤维化的作用,以期为抗纤维化的新药研发奠定理论基础。方法:选用健康雄性Wistar大鼠,随机分为3组:1)对照组(n=6),给予正常饮食及相同方法给予等量助溶剂(腹腔注射橄榄油代替30%CCl4,生理盐水灌胃代替益气活血冲剂灌胃);2)模型组(n=6),正常饮食,同时以30%四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)橄榄油溶液腹腔注射,用量为0.2ml/100g,同时生理盐水灌胃,每周2次;3)益气活血组(n=6),正常饮食,以30%CCl4橄榄油溶液腹腔注射,每周2次,并给予益气活血冲剂(3.4g/10ml/Kg/d)灌胃,饲养8周后处死动物。苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察肝组织炎症水平。Masson三色染色观察肝组织纤维化程度。免疫组化学检测Hippo-YAP1通路关键因子下游转录因子Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)及其靶基因结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)等。用Western blot技术检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)蛋白以及Hippo通路关键因子的表达,用实时定量PCR技术检测Hippo通路关键靶基因的表达。统计学分析采用单因素方差分析,组间比较采用LSD检验,P0.05代表差异具有统计学意义。结果:1.肝组织病理学观察和肝纤维化相关指标的改变:各组肝组织病理学观察可见对照组肝小叶结构正常,CCl4肝纤维化模型组中央小静脉间纤维间隔相互连接,肝结构变形。益气活血方干预组大鼠肝纤维化程度明显减轻。CCl4肝纤维化模型组α-SMA蛋白表达水平显著高于对照组和益气活血组,益气活血组α-SMA的蛋白表达下调。2 Hippo-YAP1通路关键基因蛋白及mRNA表达水平的变化2.1肝组织Hippo通路关键因子蛋白表达水平:与对照组和益气活血组相比,模型组大鼠肝脏YAP1蛋白表达水平显著增高(P0.05),而磷酸化YAP1及上游关键因子MST2蛋白表达水平显著降低(P0.05),均具有统计学意义。MST1蛋白表达水平在三组中无明显差异。2.2肝组织Hippo通路关键因子mRNA表达水平:与对照组相比,模型组大鼠肝脏YAP1和TAZ mRNA表达水平显著下降(P0.001)。模型组和益气活血方干预组相比,YAP1mRNA表达下降(P0.001)。而模型组和益气活血方干预组大鼠肝脏TAZ mRNA表达水平无明显差异。模型组大鼠肝脏CTGF、AREG mRNA表达水平明显高于对照组和益气活血方干预组(P0.001),同时Hippo-YAP1通路中YAP1上游关键因子MST1、LATS1、LATS2 mRNA表达明显低于对照组和干预组(P0.05)。三组大鼠肝脏MST2 mRNA表达水平无明显差异。3.免疫组织化学的分析:模型组大鼠肝组织中YAP1表达明显高于正常组和益气活血组(P0.05)。模型组中YAP1上游因子MST1和LATS1明显低于益气活血方干预组(P0.05)。YAP1靶基因CTGF在模型组中的表达明显高于对照组和益气活血方干预组(P0.05)。结论:1.腹腔注射CCL4的方法可成功建立大鼠肝纤维化模型。2.益气活血方可显著改善大鼠肝纤维化程度,同时下调α-SMA的表达。3.益气活血方可以通过影响MST1/MST2的表达,上调LATS1/LATS2的表达,使磷酸化的YAP1增加,活化的YAP1下调,最终抑制YAP/TAZ下游靶基因CTGF的表达,抑制Hippo-YAP1通路,实现阻止纤维化进展的作用。其中,YAP1蛋白的调节可能是由一种转录后机制所调控,MST1和MST2的作用机制还有待研究。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

小静脉,肝小叶,纤维化,大鼠

两两比较的q检验分析各组间的差异，P<0.05为差异有统计学意义。结果1.肝组织病理学观察和肝纤维化相关指标的改变：1.1HE 和 Masson 染色结果大鼠肝组织HE和Masson染色结果：对照组肝组织可见由终末小静脉向外呈放射状排列的肝细胞索。肝窦含有红细胞，肝小叶结构正常。未见纤维纤维间隔；CCL模型组大鼠中央小静脉和汇管区的桥隔进一步分裂假小叶，较小结节数量小于50％或大于50％，大鼠肝纤维化评分在S5-S6（大鼠纤维化诊断标准见实验与方法2.23）。益气活血方干预组多条中央小静脉间纤维间隔不完全包绕肝小叶，分裂肝小叶,评分为S3-S4。纤维化程度明显降低。

技术检测,相对值,蛋白表达,灰度值

1.2肝纤维化相关蛋白表达CCL4诱导的大鼠肝纤维化组与其他两组相比α-SMA的表达量明显升高(见图2)，三组大鼠肝脏α-SMA蛋白表达相对值（目的条带灰度值/内参灰度值）为0.144±0.040,0.585±0.013,0.354±0.024。益气活血方干预组与模型组相比可明显下调α-SMA的表达（P＜0.001）。图 2：Wertern blotting 技术检测正常组和模型组以及益气活血方干预组αSMA 的蛋白表达量（a-b）。代表***p＜0.001Fig.2: protein expression of SMAin normal group, model group and YQHXintervention group was detected by Wertern blotting technique.***p＜0.0012.Hippo-YAP1通路关键基因蛋白及mRNA表达水平的变化2.1 肝组织Hippo通路关键因子蛋白表达水平：对照组、模型组和益气活血组大鼠肝脏YAP1蛋白表达相对值（目的条带灰度值/内参灰度值）分别为（0.117±0.012,0.541±0.128,0.190±0.046），模型组大鼠YAP1水平显著增高（P＜0.05），磷酸化YAP1蛋白表达相对值分别为0.632±0.033，0.257±0.015,0.551±0.035，MST2蛋白表达相对值分别为0.372±0.042,0.197±0.027,0.488±0.080，磷酸化YAP1及上游关键因子MST2蛋白表达水平显著降低，均具有统计学意义（P＜0.001）。MST1蛋白表达相对值分别为0.550±0.009,0.613±0.115,0.599±0.054

关键因子,技术检测,统计学意义,相对值

及上游关键因子MST2蛋白表达水平显著降低，均具有统计学意义（P＜0.001）。MST1蛋白表达相对值分别为0.550±0.009,0.613±0.115,0.599±0.054，三组差异无统计学意义（见图3）。

【参考文献】