瑞香狼毒的质量控制及总黄酮抗肿瘤谱效关系研究

发布时间：2020-09-21 10:10

　　瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)为瑞香科狼毒属多年生草本植物,又名红狼毒、断肠草等,经过干燥的根部为其入药部位,其性味苦、平、辛、有毒,有逐水祛痰、破积杀虫的功效。药理学研究表明瑞香狼毒药材中含量较高的黄酮类、香豆素类化合物有较好的生物活性。但目前关于瑞香狼毒的质量控制中,没有同时对黄酮类和香豆素类定量测定的方法。瑞香狼毒属于大毒药材,在用药时易与大戟科狼毒大戟及月腺大戟混淆,为了用药的准确性,应建立更全面的质量控制方法,将其区分开。在现有的对瑞香狼毒指纹图谱的研究中,选用的产地较单一,不能有很好的代表性。瑞香狼毒在民间应用于治疗肿瘤等,药理学研究表明其醇提物、水提物及总黄酮等都具有广泛的抗肿瘤活性,但具体作用的有效成分尚不明确。本课题对瑞香狼毒总黄酮抗肿瘤的关键成分进行研究,提取纯化瑞香狼毒总黄酮成分,建立其指纹图谱,并将总黄酮作用于肺癌A549细胞,计算其IC50。运用灰色关联度分析法及多元线性回归法建立总黄酮指纹图谱与IC50之间的谱效关系,从而筛选出抗肿瘤的关键成分。1 UPLC法测定瑞香狼毒中伞形花内酯和狼毒色原酮的含量色谱条件为BEH C18(2.1×100 mm,1.7μm)色谱柱;流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),进行梯度洗脱;检测波长伞形花内酯:327 nm,狼毒色原酮:297 nm;流速0.3 mL·min-1;进样量2μL,柱温25℃。实验结果显示伞形花内酯、狼毒色原酮的线性范围分别为0.74~17.64μg·mL-1(r=0.9999)、14.70~352.8μg·mL-1(r=0.9998),平均回收率分别为99.20%,99.63%,RSD分别为1.81%,1.65%。13批瑞香狼毒药材中伞形花内酯的含量范围为:0~0.602 mg·g-1,狼毒色原酮的含量范围6.08~33.37 mg·g-1。该方法操作简便、快速、重现性好、结果准确可靠,可用于中药瑞香狼毒的质量控制。2 HPLC法建立瑞香狼毒药材的指纹图谱色谱条件为Hypersil GOLDaQ-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱;流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脱:0~7 min,90%~80%B;7~17 min,80%~65%B;17~32 min,65%~60%B;32~42 min,60%~50%B;42~45 min,50%~40%B;45~55 min,40%B;检测波长:290 nm;流速:1.0 mL·min-1;柱温:25℃;进样量:10μL。方法学验证表明精密度好,专属性高。运用相似度评价、聚类分析方法对药材质量进行综合评价,确定了14个共有峰,不同产地间的相似度大都在0.9以上,说明不同产地间药材的化学成分组成基本一致。3 UPLC法建立瑞香狼毒药材的指纹图谱色谱条件为Waters BEH C18(2.1×100 mm,1.7μm)色谱柱;流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脱:0~2 min,90%~80%B;2~3.5 min,80%~70%B;3.5~6.5 min,70%~60%B;6.5~8 min,60%~50%B;8~10 min,50%~40%B;10~15 min,40%B;检测波长:290nm;流速:0.3 mL·min-1;柱温:25℃;进样量:2μL。方法学验证表明精密度好,专属性高。运用相似度评价、聚类分析对药材质量进行综合评价,确定了16个共有峰,不同产地间的相似度大都在0.9以上,这与HPLC法建立的指纹图谱结果相符合,且UPLC具有更好的分离效果。4 HPLC法建立瑞香狼毒总黄酮的指纹图谱色谱条件为Hypersil GOLDaQ-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱;流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脱:0~10 min,80%~65%B;10~25 min,65%~60%B;25~45 min,60%~50%B;45~50min,50%B;检测波长:297 nm;流速:1.0 mL·min-1;柱温:25℃;进样量:10μL。方法学验证表明精密度好,专属性高。运用相似度评价系统,确定了11个共有峰。5瑞香狼毒总黄酮对肺癌A549细胞的抑制作用采用MTT法测定瑞香狼毒总黄酮对A549细胞的增殖抑制作用,呈现时间和剂量的依赖性。48h的最高抑制率为81.76%.不同产地的瑞香狼毒总黄酮的抑制率不同。6瑞香狼毒总黄酮抗肿瘤谱效关系瑞香狼毒总黄酮指纹图谱的11个共有峰与抗肿瘤的IC50的灰色关联度排序为P1、P7、P6、P2、P11、P10、P5、P8、P9、P4、P3,其中P2为伞形花内酯,P7为狼毒色原酮。11个共有峰与抗肿瘤的IC50的多元线性回归方法分析结果显示P1、P4、P5、P7、P9、P10、P11和抗肿瘤效应有关,谱效方程为:Y=-0.591P1-2.044P4+0.442P5+0.372P7+2.969P9-0.996P10+0.560P11;P1、P4、P10与抑制A549细胞效应呈负相关,P5、P7、P9、P11与抑制A549细胞效应呈正相关。综上所述,本研究首次建立了UPLC法测定伞形花内酯和狼毒色原酮的含量,比较了HPLC和UPLC法指纹图谱的区别,且本研究的药材较以往的研究,来源更为广泛。采用谱效关系的方法确定了与瑞香狼毒抗肿瘤效应有关的成分,为以后建立更具有针对性的质量控制方法打下基础。
【学位单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R284;R285

【参考文献】