芹黄素对小胶质细胞微环境的影响

发布时间：2020-09-22 19:18

　　 [目的]体外研究芹黄素(API)对活化状态下的小胶质细胞分泌炎症因子、炎症相关蛋白、抗炎因子以及神经营养因子的影响。[方法]1.解剖分离新生24hSD大鼠大脑皮质,经胰酶消化及机械吹打制成单细胞悬液,接种于培养基,14d后,纯化小胶质细胞并进行CD11b/c免疫细胞化学鉴定。2.将纯化后的小胶质细胞用相同浓度的脂多糖(LPS)(100ng/ml)分别处理不同的时间(1h,2h,4h,6h,8h,10h),ELISA法检测经LPS处理不同时间后小胶质细胞分泌炎症因子(IL-1、TNF-α)的变化,确定炎症因子分泌最多的时间用于后续实验。3.将纯化后的小胶质细胞分别经不同浓度(浓度梯度:5uM/L、20 uM/L、40uM/L、60 uM/L)的芹黄素处理48h,MTT法比较各浓度之间小胶质细胞活性。选取对小胶质细胞活性影响最小的浓度用于后续实验。4.将纯化后的小胶质细胞随机分为以下6组:空白对照组(PBS处理)、脂多糖组(LPS组)、脂多糖+芹黄素5uM组(LPS+API 5uM组)、脂多糖+芹黄素20uM 组(LPS+ API 20uM 组)、脂多糖+芹黄素 40uM 组(LPS+ API 40uM 组)、脂多糖+芹黄素60uM组(LPS+API 60uM组)。5.采用ELISA法分别检测以上6组炎症因子(IL-1、TNF-α)、抗炎因子(IL-10)以及神经营养因子(BDNF、PDNF、GDNF)的表达情况。6.采用实时荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测以上6组小胶质细胞炎症相关蛋白一氧化氮合酶(iNOS)的表达情况。[结果]1.对新生SD大鼠小胶质细胞进行混合培养、纯化后,CD11b/c染色阳性,所得到的小胶质细胞纯度95%。2.小胶质细胞经LPS诱导后,炎症相关因子IL-1表达上调,并于6h时达到高峰。3.MTT法检测结果:小胶质细胞经一定浓度范围内(5-60uM/L)的芹黄素处理后,其活性并未发生明显改变。4.ELISA法检测结果:LPS组小胶质细胞炎症因子IL-1、TNF-α表达量明显增多,而抗炎症因子IL-10表达量则明显减少;而LPS+API各组较LPS组,炎症因子IL-1、TNF-α表达量都有明显下降,抗炎症因子IL-10表达量明显增多,而不同浓度芹黄素水平之间未表现出明显差异;LPS+API各组营养因子GDNF、BDNF、PDNF表达量均明显高于单独LPS组。5.RT-PCR及Western Blot检测结果:单独LPS组炎症相关基因iNOS转录及表达水平明显高于其他各组。而LPS+API各组可显著降低iNOS转录及表达水平。[结论]芹黄素可以抑制活化状态下的小胶质细胞炎症因子的分泌及炎症相关蛋白的表达,同时可促进神经营养因子的释放。为进一步进行动物体内实验提供了 一定的理论基础。
【学位单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

显微镜观察小胶质细胞特异性抗体ＣＤｌｌｂ／ｃ，免疫化学染色鉴定结果呈阳性，纯逡逑化后小胶质细胞纯度＞９５％。荧光显微镜下观察，红色为ＣＤｌｌｂ／ｃ染色，蓝色为逡逑ＤＡＰＩ核染色。（图１，邋２）逡逑露．：：逡逑图１分离纯化后的小胶质细胞形态，呈分枝状或梭状。Ｂａｒ＝１０（Ｖｍ逡逑ＣＤｌｌｂ／ｃ逦ＤＡＰＩ逦Ｍｅｒｇｅｄ逡逑■ＨＵ逡逑图２邋ＳＤ大鼠小胶质细胞分离纯化后使用ＣＤｌｌｂ／ｃ染色阳性。Ｂａｒ＝１０0ｎｍ逡逑２逦ＬＰＳ上调小胶质细胞炎症相关因子１Ｌ－１和ＴＮＦ－ａ表达水平逡逑纯化后的小胶质细胞经ＬＰＳ邋（ｌｍｇ／Ｌ）处理不同时间（ｌｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、逡逑８ｈ、ｌＯｈ）后，其分yU的炎症因子ＩＬ－１和ＴＮＦ－ａ均上调，在６ｈ时达到高峰（木／３逡逑＜０．０５，料产＜０＿０１，＊＊＊尸＜０．００１，图３，４）逡逑１８逡逑

纯化后的小胶质细胞经ＬＰＳ邋（ｌｍｇ／Ｌ）处理不同时间（ｌｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、逡逑８ｈ、ｌＯｈ）后，其分yU的炎症因子ＩＬ－１和ＴＮＦ－ａ均上调，在６ｈ时达到高峰（木／３逡逑＜０．０５，料产＜０＿０１，＊＊＊尸＜０．００１，图３，４）逡逑１８逡逑

最终形成不同片黄素浓度梯度（５ｕＭ、２０ｕＭ、４０ｕＭ、６０ｕＭ）的混合逡逑液。ＭＴＴ实验结果显示，在此浓度范围内浓度芹黄素对小胶质细胞的活性并无逡逑明显影响。（图５）逡逑１５０ｒ逡逑『■■■Ｉ逡逑r．\lw冢慑澹咤义

本文编号：2824812