大鼠腹膜透析对雷公藤内酯醇及其代谢物清除作用的研究

发布时间：2020-09-27 08:16

　　目的:雷公藤内酯醇(Triptolide,TPL)是雷公藤最主要的有效成分和毒性物质。TPL具有高效的免疫抑制、抗肿瘤、抗炎、抗生育等作用,在这些领域具有广泛的应用。然而TPL毒性大且治疗窗窄,极易发生中毒,目前尚无拮抗剂。腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)是血液净化技术的一种,利用腹膜作为透析膜清除体内毒物,抢救成功率高。目前尚无文献对TPL的可透析进行科学的验证,故建立大鼠腹膜透析(PD)模型研究PD对TPL及其代谢物的清除作用,对TPL的可透析性进行了探讨,为将来TPL应用于临床发生急性中毒情况时,运用PD等血液净化方式救治TPL中毒患者提供试验依据。方法:1、采用LC-MS结合平衡透析法,选择25、50、100ng/ml三个浓度对TPL在SD大鼠、Beagle犬及人血浆中的蛋白结合率进行测定。2、建立大鼠PD模型,通过优化不同的腹透周期、腹透剂量,确定最佳的PD方案。3、将大鼠分为TPL组和TPL+PD组。TPL组:大鼠单次尾静脉LD50剂量的TPL后在规定时间内采血;TPL+PD组:大鼠iv TPL后即刻进行PD,并在规定时间内采血。收集血浆及腹透液样品后用LC-MS测定血浆及腹透液中TPL的浓度,用药动学DAS软件计算药动学参数并对两组的动力学参数进行比较,并分析腹透液中的TPL变化规律。4、采用LC-MS技术分离鉴别TPL内源性代谢物,并测定血浆及腹透液中TPL代谢物的浓度,用药动学DAS软件计算药动学参数并对两组的动力学参数进行比较。5、iv LD50剂量的TPL染毒后的大鼠在不同时间取血,按照试剂盒说明书测ALT、AST、LDH、CRE、BUN。以空白血作为自身对照,研究TPL染毒后大鼠的生化指标的变化,确定生化指标的最佳检测时间点。6、将大鼠分为正常组、假手术组、TPL组、TPL+PD组4组。正常组:iv等体积0.9%NS;假手术组:造模并iv等体积0.9%NS;TPL组:iv LD50剂量的TPL;TPL+PD组:造模并iv LD50剂量TPL后进行PD。4组均在12h处死取血测ALT、AST、CRE、BUN,取心、肝、脾、肺、肾进行HE染色,对各组的血浆生化及病理改变进行分析比较。结果:1、TPL与大鼠、Beagle犬和人血浆蛋白结合率均无浓度依赖性。TPL与SD大鼠的血浆蛋白结合率最高(41.02±1.28)%,与Beagle犬(31.25±3.60)%、人血浆(34.99±2.89)%相比均有极显著性差异(p0.01);人血浆蛋白结合率和Beagle犬血浆蛋白结合率之间差异具有显著性(p0.05)。2、成功建立大鼠PD模型。腹透周期为10min/cycle,腹透剂量为150ml/kg时透析出的TPL量最高。3、TPL消除快,在180min后低于检测限。TLP+PD组的Cmax、AUC0~180明显小于TPL组(p0.01);TPL+PD组的Vd大于TPL组(p0.05);TPL+PD组的CLz明显大于TPL组(p0.01)。PD对TPL的清除率为26.66%。腹透液中TPL量以第1PD周期为最高,随时间增加逐渐下降。4、TPL主要有4大类代谢物,双羟基化雷公藤内酯醇(有6种,命名为DHTPL1~6),羟基化雷公藤内酯醇(有2种,命名为HTPL1~2)、甲基化雷公藤内酯醇(MTPL)、脱水羟基化雷公藤内酯醇(DHHTPL)。TPL代谢物消除较快,在大鼠体内呈先上升后逐渐下降的趋势,大部分代谢物在6min达到高峰。体内滞留时间的顺序为HTPLDHTPLMTPL=TPLDHHTPL,分别在6h、5h、2h、2h、1h后低于检测限。5、TPL+PD组TPL代谢物的AUC均小于TPL组。PD对TPL各代谢物的清除率分别为DHTP1(22.08%)、DHTPL2(31.56%)、DHTPL3(24.29%)、DHTPL4(33.86%)、DHTPL5(25.34%)、DHTPL5(31.47%)、HTPL1(27.41%)、HTPL2(28.29%)、MTPL(14.87%)、DHHTPL(23.74%)。大部分代谢物在腹透液中的含量在第1PD周期达到最高,随PD时间的增加逐渐下降。6、大鼠iv TPL后,短时间(约12h)内血浆中的ALT、AST、LDH、BUN均呈先上升达到峰值后逐渐下降到正常水平的趋势,12h时ALT、AST、LDH、BUN的水平与0h相比均显著升高,差异具有统计学意义(p0.05或p0.01)。CRE变化不明显。7、与正常组比较,TPL组和TPL+PD组ALT、AST、LDH、BUN水平均升高,差异均有统计学意义(p0.05或p0.01),假手术组没有明显改变;TPL+PD组与TPL组比较,TPL+PD组的ALT、AST、LDH、BUN水平均低于TPL组(p0.05)。HE染色中,正常组、假手术组的大鼠均未见明显病理改变;TPL组和TPL+PD组均有肝细胞受损、坏死,肾小管上皮细胞肿胀、少数肾小管上皮细胞坏死、管腔分泌物增多,脾小结缩小、淋巴细胞坏死、数目减少等病理改变,TPL+PD组的肝细胞损害、肾小管管腔渗出物和淋巴细胞坏死程度轻于TPL组。结论:1、TPL具有较低的血浆蛋白结合率,在血浆中大部分游离;TPL与大鼠、Beagle犬和人血浆蛋白结合率无浓度依赖性;TPL血浆蛋白结合率具有种属差异性。2、成功建立大鼠PD模型。最佳的PD方案为150ml/kg,10min/cycle。3、PD对TPL的清除率为26.66%。TPL主要有4大类代谢物,PD对TPL各代谢物的清除率约为15%~30%。TPL中毒时应尽早使用PD,使TPL代谢物尽快排出体外。4、大鼠iv LD50剂量的TPL后12h可作为生化指标的最佳检测时间点。肝脏、肾脏、脾是TPL急性毒性作用重要的靶器官,PD能减轻TPL对肝、肾、脾的损害,并有利于血清酶ALT、AST、BUN、LDH水平的恢复。5、PD是TPL急性中毒的有效血液净化手段,故发生TPL中毒时尽早使用PD等血液净化方式清除TPL及其代谢物。
【学位单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

色谱图,缓冲液,色谱图,样品

44%）进行洗脱。而对于透析外液缓冲液采用 Eclipse plus C18色谱柱，等度洗脱（水-甲醇=56：44），使 TPL 的出峰时间提前，节省整个分析周期。在此条件下测得的 TPL保留时间合适，峰型良好。3.2 血浆及缓冲液样品预处理方法的选择透析内液（血浆）选择乙酸乙酯液液萃取法；预实验发现缓冲液中的化学成分对色谱柱及质谱并没有明显的影响，所以可直接进样测定。3.3 TPL 血浆蛋白结合率测定方法的选择3.3 方法学验证3.3.1 专属性考察图 1-1结果表明，在本实验的色谱条件下，大鼠血浆中测得的 TPL的保留时间约为 2.84min（缓冲液中约为 3.02min），说明血浆和缓冲液中内源性物质及其它成分均不干扰 TPL的含量测定，且分离度良好，峰形良好。

曲线,定量标准,缓冲液,精密度

图 1-2 SD 大鼠血浆及缓冲液中 TPL 的定量标准曲线Fig. 1-2 Quantitative standard curve of TPL in plasma and buffer of SD rats3.3.3 精密度与准确度的考察结果见表 1-1，日内和日间精密度 RSD均小于 5.0%，准确度在 95%～105%，均符合《化学药物非临床研究技术指导原则》的基本要求。表 1-1 SD 大鼠模拟血浆和缓冲液样品的精密度和准确度考察结果（n=5）Tab.1-1 Precision and accuracy of TPL in simulated plasma and buffer samples of SD rats (n = 5)样品TPL 添加浓度（ng/ml）日内精密度RSD（%）日间精密度RSD（%）准确度RR（%）模拟血浆样品25 3.15 3.88 98.1650 1.82 2.22 103.75125 2.66 3.53 95.89模拟缓冲液样品20 2.30 3.30 99.3150 0.49 3.71 102.3875 0.49 2.47 100.89

平衡时间,统计学意义,种属,蛋白结合率

图 1-3 血浆样品的平衡时间考察结果(n=3， x s) 1-3 Results of equilibration time of plasma samples (n=3，种属血浆蛋白结合率的测定种属的血浆蛋白结合率见表 1-5，结果 TPL蛋白结围内无浓度依赖性，SD大鼠血浆中 TPL三个浓度、40.82%，差异没有统计学意义（p>0.05）；Bea、28.21%，差异没有统计学意义（p>0.05）；人血，差异没有统计学意义（p>0.05）。TPL蛋白结合D大鼠的血浆蛋白结合率最高 41.02±1.28 %，与 %、人血浆蛋白结合率 34.99±2.89 %相比具有极显浆蛋白结合率和 Beagle犬血浆蛋白结合率之间具表 1-5 TPL 与不同种属的血浆蛋白结合率（n=3， x s）

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