雄黄在肠道菌群内的砷形态分析及砷代谢初步研究
发布时间：2020-09-28 21:02
【摘要】：雄黄入药始载于《神农本草经》,具有解毒杀虫,燥湿祛痰,截疟的功效,在我国的临床使用己有几千年的历史。从20世纪50年代以来,就有国内医者将含雄黄的复方制剂或单方用于医治血液系统疾病、恶性淋巴系统疾病乃至实体瘤,取得了显著的治疗效果。但是由于具有毒性,故雄黄及其含有雄黄的成方制剂的安全使用就显得至关重要。雄黄的毒性不仅和雄黄中砷的总量有关,还和砷的化学形态及其代谢产物密切相关。不同价态,不同化学形式的砷化合物,其毒性可相差成千上万倍。肠道是口服药物在体内代谢的重要场所,肠道内寄生的大量细菌对药物的生物转化起到了非常重要的作用。目的:通过测定雄黄中的总砷,并对雄黄中的可溶性砷的提取条件进行优化,检测雄黄中可溶性砷的砷形态,初步研究As单元素和雄黄中可溶性砷在肠道菌群作用下的砷形态及砷代谢,测定肠道菌群中的还原型谷胱甘肽(GSH),为阐述肠道菌群中砷形态的生物转化奠定一定的基础。方法:1.采用微波消解-氢化物原子吸收光谱仪和微波消解-电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分别对雄黄中的总砷进行测定。2.利用Plackett-Burman和Box-Behnken设计优化雄黄中可溶性砷的提取工艺。3.建立高效液相色谱(HPLC)—电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)联用技术同时分离检测AsB、AsC、As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA六种砷形态化合物的方法,并检测As单元素和雄黄在肠道菌群作用下的砷形态。4.建立DTNB法测定肠道菌群中还原型谷胱甘肽(GSH)。结果:1.微波消解-氢化物原子吸收光谱仪和微波消解-电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定雄黄中的砷含量以二硫化二砷(As2S2)计分别为96.20%和97.07%。2.利用Plackett-Burman和Box-Behnken设计优化雄黄中可溶性砷的最佳提取工艺为:以水作为提取溶剂,雄黄15mg,水10mL,提取温度80℃,超声提取3次,每次60min,雄黄中可溶性砷占总砷的4.16%。3.建立高效液相色谱(HPLC)—电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)联用技术同时分离检测AsB、AsC、As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA六种砷形态的方法,采用DionexIonPacTMAS7RFICTM阴离子交换色谱柱(4x250 mm)作为分析柱,流动相A相:3.75 mM碳酸铵,流动相B相:100 mM碳酸铵。梯度洗脱,0.00～3.40 min,100%A;3.50 min 20%A,80%B;4.50～6.00 min 100%B;6.10～8.00 min 100%A。流速为1.2mL/min,进样体积为20μL。实验结果表明,六种砷形态的线性范围为 1～100 ng/mL,R2 均大于 0.9990,检出限为 0.1～0.2ng/mL,精密度 RSD 在 0.93%-1.83%,均小于2%。方法加标回收率为97.28%～105.24%,RSD均小于6%。采用优化后的最佳提取工艺提取雄黄中的可溶性砷。结果表明:雄黄可溶性砷中的砷形态为As(Ⅲ)、As(V),且As(Ⅲ)含量高于As(V)。As单元素中只含有As(V)。采用超声水浴的方法对肠道菌群样品进行提取。实验结果表明:雄黄可溶性砷与As单元素在肠道菌群的作用下,通过HPLC-ICP-MS只检测到的砷形态为As(Ⅲ)、As(V)。4.通过DTNB法测定0-48h肠道菌群中还原型谷胱甘肽(GSH),在0～2 h未检测到GSH,在4 h时达到峰值50.36μg/mL,12～48h 趋于稳定,48h 为 13.30μg/mL。结论:1.雄黄中的砷含量以二硫化二砷(As2S2)计均大于2015版《中国药典》规定的90%,符合药典要求。2.Plackett-Burman和Box-Behnken设计优化雄黄中可溶性砷的提取工艺稳定可靠,实验精度高,与模型预测值基本一致。3.建立HPLC-ICP-MS同时测定六种砷形态,该方法采用As-7阴离子色谱柱分离六种砷形态化合物,分离效果良好,各砷形态化合物都达到了完全分离,能使检测结果更加准确可靠,可运用于雄黄中可溶性砷的砷形态、肠道菌群中的砷形态分析。4.首次通过DTNB法测定肠道菌群中的GSH,表明肠道菌群中存在还原型谷胱甘肽(GSH),可能对无机砷的甲基化代谢过程有着重要的作用,对于无机砷在肠道菌群内的甲基化代谢过程还需进行更为深入的研究。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：
３．１提取溶剂的选择逡逑对“２．３．１”项下不同提取溶剂制备的样品溶液进行测定，样品溶液可溶性砷的测定逡逑按照“２．２．１”项下ＩＣＰ－ＭＳ参数进行测定。结果如图１所示。逡逑可溶性砷含量（ｍｇ／ｇ）逡逑１５逦１２．０２逡逑0逡逑５逦■■■■Ｈｉ逡逑０逡逑水邋０．５％磷酸邋１％磷酸邋２％磷酸人工肠液人工胃液逡逑图１不同提取溶剂对雄黄中可溶性砷的影响逡逑从图１可以看出，水作为提取溶剂，可溶性砷的含量明显高于其他提取溶剂，最终逡逑选用水作为雄黄中可溶性砷的提取溶剂。逡逑３．２邋Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计筛选显著性因素逡逑Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂ＿ａｎ设计生成的１２次实验，每组实验平行３次，按“２．１．４”项下制备逡逑方法进行１２组实验各样品溶液的制备，样品溶液可溶性砷的测定按照“２．２．１”项下ＩＣＰ－逡逑ＭＳ参数进行测定。实验结果以提取率的３次平均值为考察指标，实验结果见表６，邋５逡逑３５逡逑
逡逑个因素对考察指标影响的主次见图２。雄黄的总砷含量己在“第二章”中进行了测定，逡逑以雄黄样品的含砷量以二硫化二砷（Ａｓ２Ｓ２）计为９７．０７％，总砷含量为６８．０４％。逡逑表６邋Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ实验设计及结果（ｎ＝３）逡逑因素逡逑运行顺序逦Ｔ逦ｔ逦ｎ逦Ｖ逦Ｄ逦提取率（％）逡逑１逦＿逦？逦－逦＋逦＋逦１．３８５逡逑２
Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计实验筛选出了邋３个比较显著的影响因素，因此提取优化中以提逡逑取率的最大值为目标，通过Ｍｉｎｉｔａｂ软件中ＤＯＥ功能中的响应曲面的响应优化器，对目逡逑标参数进行优化，结果如图３所ＺＫ，确定优化提取工艺为提取温度为８０邋Ｃ，超尸提取３逡逑次，提取时间为每次６０邋ｍｉｎ。逡逑|儒翁崛〈问奔溴义宪礤危福埃板危常板危梗埃板义希模哄澹保埃埃板吻咤危郏福埃埃蒎危郏常埃蒎危郏叮埃啊垮义希咤蔚湾危
本文编号：2829270
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：
３．１提取溶剂的选择逡逑对“２．３．１”项下不同提取溶剂制备的样品溶液进行测定，样品溶液可溶性砷的测定逡逑按照“２．２．１”项下ＩＣＰ－ＭＳ参数进行测定。结果如图１所示。逡逑可溶性砷含量（ｍｇ／ｇ）逡逑１５逦１２．０２逡逑0逡逑５逦■■■■Ｈｉ逡逑０逡逑水邋０．５％磷酸邋１％磷酸邋２％磷酸人工肠液人工胃液逡逑图１不同提取溶剂对雄黄中可溶性砷的影响逡逑从图１可以看出，水作为提取溶剂，可溶性砷的含量明显高于其他提取溶剂，最终逡逑选用水作为雄黄中可溶性砷的提取溶剂。逡逑３．２邋Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计筛选显著性因素逡逑Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂ＿ａｎ设计生成的１２次实验，每组实验平行３次，按“２．１．４”项下制备逡逑方法进行１２组实验各样品溶液的制备，样品溶液可溶性砷的测定按照“２．２．１”项下ＩＣＰ－逡逑ＭＳ参数进行测定。实验结果以提取率的３次平均值为考察指标，实验结果见表６，邋５逡逑３５逡逑
逡逑个因素对考察指标影响的主次见图２。雄黄的总砷含量己在“第二章”中进行了测定，逡逑以雄黄样品的含砷量以二硫化二砷（Ａｓ２Ｓ２）计为９７．０７％，总砷含量为６８．０４％。逡逑表６邋Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ实验设计及结果（ｎ＝３）逡逑因素逡逑运行顺序逦Ｔ逦ｔ逦ｎ逦Ｖ逦Ｄ逦提取率（％）逡逑１逦＿逦？逦－逦＋逦＋逦１．３８５逡逑２
Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计实验筛选出了邋３个比较显著的影响因素，因此提取优化中以提逡逑取率的最大值为目标，通过Ｍｉｎｉｔａｂ软件中ＤＯＥ功能中的响应曲面的响应优化器，对目逡逑标参数进行优化，结果如图３所ＺＫ，确定优化提取工艺为提取温度为８０邋Ｃ，超尸提取３逡逑次，提取时间为每次６０邋ｍｉｎ。逡逑|儒翁崛〈问奔溴义宪礤危福埃板危常板危梗埃板义希模哄澹保埃埃板吻咤危郏福埃埃蒎危郏常埃蒎危郏叮埃啊垮义希咤蔚湾危
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