苦瓜苷G调节巨噬细胞阻止肺损伤和肺癌前病变作用

发布时间：2020-09-29 06:35

　　肿瘤的恶性进展与组织损伤密切相关。恶性肿瘤常发生在慢性损伤部位,慢性损伤所导致的炎症是癌症发展的主要危险因素。巨噬细胞在组织损伤及修复中具有重要作用,其在不同的环境中激活为不同的表型,通常表现为经典活化的M1型和替代活化的M2型。M1型巨噬细胞以分泌IL-6,NO,ROS为主,具有促炎和组织损伤的作用;M2型巨噬细胞以分泌IL-10和TGF-β为主,在抗炎和组织损伤修复中起关键作用。苦瓜苷G是从苦瓜中提取的主要活性成分,具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等药理作用,其防治肿瘤作用是否与影响巨噬细胞相关未有报道。本实验的目的是探究巨噬细胞极化表型在苦瓜苷G阻止肺损伤和癌前病变中的作用及机制。本实验分为体内研究,体外研究,机制研究三个部分进行。在体外实验中,分别用LPS和IL-10极化RAW264.7为M1样和M2样巨噬细胞,以不同浓度的苦瓜苷G处理M1样和M2样巨噬细胞,免疫荧光检测对巨噬细胞表型的影响;MTT检测对巨噬细胞增殖能力的影响;中性红和吞噬细菌实验检测对巨噬细胞吞噬能力的影响;激光全息细胞成像分析对细胞形态的影响;Annexin V-FITC/PI染色检测对凋亡的影响。体内实验,建立乌拉坦诱导肺癌模型,HE染色法检测乌拉坦诱导肺癌过程中小鼠肺部病理变化;免疫荧光检测肺组织中NLRP3表达,评价苦瓜苷G对肺损伤和肺癌前病变的影响。建立LPS肺损伤模型,采用氯屈膦酸钠脂质体(LEC)耗竭巨噬细胞、过继性输注M1样和M2样巨噬细胞检测巨噬细胞在肺损伤中的作用。使用动物呼吸能量代谢测量系统监测小鼠肺功能变化;伊文思蓝染色检测小鼠肺上皮细胞通透性变化;干湿法检测小鼠肺水含量影响;HE染色法检测小鼠肺部病理变化,评价苦瓜苷G对肺损伤的影响及这种影响与巨噬细胞的相关性。机制研究中,体外极化的巨噬细胞培养中,AO染色检测巨噬细胞中红色酸性囊泡(AVOs)、免疫荧光和Western blot检测自噬相关蛋白LC3-B、P62表达,观察细胞自噬;荧光探针DCFH-DA检测细胞内的ROS;ELISA试剂盒测试IL-12,IL-10和TGF-β水平;比色测定试剂盒检测NO(一氧化氮)水平,评价苦瓜苷G对不同极化表型巨噬细胞功能的影响。乌拉坦诱导肺癌模型中,免疫荧光检测苦瓜苷G对肺泡中巨噬细胞表型的影响,ELISA试剂盒检测IL-6,IL-12,IL-10,TGF-β水平变化;LPS诱导肺损伤模型中,免疫荧光和Western blot检测苦瓜苷G对肺部巨噬细胞表型的影响,验证苦瓜苷G的肺损伤和肺癌前病变阻止作用与改变巨噬细胞表型的相关性。最后,运用网络药理学分析苦瓜苷G调控巨噬细胞表型的可能机制。体外结果显示,苦瓜苷G增加巨噬细胞的吞噬能力,在不影响M2样巨噬细胞活性的剂量下,抑制M1样巨噬细胞增殖,改变其细胞形态、诱导其凋亡。体内结果显示,在乌拉坦诱导肺癌模型中,乌拉坦呈时间依赖性导致肺损伤和癌前病变,苦瓜苷G能显著阻止肺损伤和癌前病变,这种作用具有巨噬细胞依赖性。在LPS诱导肺损伤模型中,输注IL-10诱导的M2样巨噬细胞改善肺损伤,输注LPS诱导的M1样巨噬细胞加剧肺损伤;苦瓜苷G降低M1样巨噬细胞的促进损伤功效,与输注M2样巨噬细胞协同改善肺功能、肺通透性和肺损伤。机制研究显示,苦瓜苷G体外促进M1巨噬细胞自噬,降低其ROS、NO、IL-12水平,升高IL-10、TGF-β水平,相对增加了M2样巨噬细胞比率。在乌拉坦诱导肺癌模型中,苦瓜苷G增加肺泡Arginase+巨噬细胞,升高肺泡灌洗液中IL-10、TGF-β水平,降低IL-12、IL-6水平;LEC删除巨噬细胞后苦瓜苷G的肺损伤和癌前病变阻止作用减弱。在LPS诱导的肺损伤模型中,苦瓜苷G降低M1样标志物iNOS表达、增加M2样标志物Arginase表达。网络药理学结果表明苦瓜苷G通过NF-κB,PPAR等信号通路降低M1样巨噬细胞表型、维持其M2样表型。综上所述,M2样巨噬细胞在组织损伤修复中扮演重要角色,组织损伤的及时治愈可以阻止肺癌前病变,苦瓜苷G可以选择性地抑制M1样并促使其向M2样巨噬细胞转化促进肺损伤愈合、进而阻止肺癌前病变。
【学位单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

巨噬细胞,苦瓜,对极

图 2-1 苦瓜苷 G 对极化巨噬细胞表型的影响Fig 2-1 Effect of mommordicoside G on polarized macrophages phenotypesestern blot 检测 M1 样、M2 样巨噬细胞 Arginase 表达显示:苦瓜苷 G 处理 M1 样、M2 样巨噬细胞后 Arginase 的表达增加P < 0.05 vs Control）图 2-2 极化巨噬细胞 Arginase 的表达Fig 2-2 Expression of polarized macrophageArginase

巨噬细胞,苦瓜

（如图2-2）（*P < 0.05 vs Control）图 2-2 极化巨噬细胞 Arginase 的表达Fig 2-2 Expression of polarized macrophageArginase2.4.2 苦瓜苷 G 对 M1 样、M2 样巨噬细胞形态的影响

苦瓜,巨噬细胞,对极

图 2-3 苦瓜苷 G 对极化巨噬细胞形态的影响Fig 2-3 Effect of Momordicoside G on the Morphology of polarized macrophages2.4.3 苦瓜苷 G 对 M1 样、M2 样巨噬细胞增殖能力的影响实验结果显示：不同浓度的苦瓜苷 G 处理 M1 样和 M2 样巨噬细胞后，检测发现苦瓜苷 G 抑制 M1 样巨噬细胞的增殖但对 M2 样巨噬细胞无明显的影响。（如图 2-4）（*P< 0.05, **P < 0.01 vs Control）。图 2-4 苦瓜苷 G 对极化巨噬细胞增殖能力的影响

【参考文献】