基于LncRNA-mRNA芯片技术的类叶牡丹抗类风湿性关节炎作用的机制研究
发布时间：2020-09-30 00:49
目的:类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以关节滑膜肿胀为主要特征的慢性炎症自身免疫性疾病,发病率为0.5%-]%左右,是世界范围内难治性的重大疾病之一。由于RA的病因与症候的复杂性,目前尚未找到特效的治疗RA的药物,迫切需要开发新型治疗药物。类叶牡丹有效部位能够调控炎症细胞因子水平,调节细胞免疫及体液免疫功能,同时能够抑制血管新生、减缓滑膜血管翳的形成与增殖,减轻关节软骨及骨的破坏,对类风湿性关节炎免疫等亢进性疾病具有良好治疗作用。本文对其抗RA作用及作用机制进行了分析。方法:MTT方法检测类叶牡丹有效部位及其特征性成分对L929细胞的毒性,确定类叶牡丹有效部位及其特征性成分的给药浓度范围;采用MTT方法确定诱导剂TN F-α的诱导浓度并建立小鼠成纤维L929细胞炎性反应模型,采用Elisa酶联免疫技术以IL-6表达水平为指标对类叶牡丹有效部位及其特征性成分的抗炎活性进行比较,通过细胞形态学观察进一步确定有效部位的有效浓度l采用LncRNA-mRNA芯片技术,筛选空白组与模型组,类叶牡丹有效部位给药组与模型组之间的差异基因,并对数据进行聚类富集分析,寻找类叶牡丹有效部位抗RA的潜在靶点和通路l利用qPCR检测空白组、模型组及给药组三组之间Hist1h2bj、Hist1h2ba、Zfp36、Ccl3、Cxcl2、Egr1的表达情况,验证类叶牡丹有效部位对上述因子的调控作用,以验证与芯片数据的一致性。结果:MTT法测定结果显示,在特征性成分浓度相同时,毒性由大到小顺序为CLC、葳严仙碱B、木兰碱、N-甲基金雀花碱,通过统计学分析计算出类叶牡丹有效部位、CLC、木兰碱、N-甲基金雀花碱、葳严仙碱B的 IC50 值分别为 199.87μg/mL、809.19μM、3172.92μM、4754.46μM、2838.307μM,确定给药浓度范围需低于其IC50值。通过MTT方法确定诱导剂TNF-a的诱导浓度为5 ng/mL,Elisα法检测IL-6的表达水平发现,类叶牡丹有效部位、CLC、木兰碱、N-甲基金雀花碱、葳严仙碱B在降低IL-6水平中均呈现剂量依赖性,同浓度下特征性成分降低IL-6的水平由高到低为CLC葳严仙碱B木兰碱N-甲基金雀花碱。CLC抗炎作用为特征性成分中最好,葳严仙碱B与CLC降低IL-6水平较为接近,但与有效部位相比降低IL-6水平均低于有效部位,选择抗炎效果较好的有效部位进行细胞形态学观察,结果显示,TNF-α诱导后的L929细胞呈现形态轮廓不清晰,边缘不整齐,细胞相对密度减小,大部分细胞皱缩变圆并出现破碎现象。与15.625 μg/mL、3 1.25 μg/mL、62.5 μg/mL类叶牡丹有效部位共同孵育组均能对细胞形态有所修复,细胞轮廓清晰,能明显看到细胞的核仁等内部结构,且细胞数目增多,梭形状态细胞增多,皱形状态细胞减少。当浓度达到125 μg/mL时,反而对细胞形态修复作用减弱,梭形细胞数目减少,皱形细胞数目增多,细胞边缘不清晰,相对密度减小,确定有效部位有效浓度为62.5 μg/mL。LncRNA-mRN A芯片数据显示,TNF-α模型组与空白组相比,差异基因总数为433条,其中上调基因298条,下调基因135条;类叶牡丹有效部位给药组与模型组相比,差异基因总数为384条,其中上调基因202条,下调基因1 82条。筛选获得与药物作用显著相关基因:Hist 1 h2ak、Hist 1 h2bf、Hist1h2ba、Hist1h2ao、Hist1h2an、Jun、Hist1h2ai、Hist1h2ag、Hist1h3a、Hist1h3i、Hist1h2bc、Hist1h2bn、Hist1h3e、Hist2h4、Hist1h2af、Hist1h4j、Hist1h3g、Hist1h4f、Hist1h4k、Hist1h4c、Ptgs2、Egr1、Tlr2、Hist1h1a、Serpine1、Ccl7、Fosb、Nfkbia、Ccl3、Cyr61、Lrr1、Ier2、Cdkn3、Cxcl3、Kif11、Psmd8、Dub2a、Tmeml73、Dub1、Klf6、Cab391、Dusp5、Gdfl5,且对于参与RA发生和发展的多条通路有显著作用,通过基因芯片数据GO富集分析,发现类叶牡丹有效部位在分子功能上主要作用于趋化因子,在生物过程中主要影响蛋白DNA复合物的组装、核小体组装、染色质组装与分解、DN A合成、DN A构象变化、蛋白聚合细胞白细胞介素-1响应,在细胞组成中主要对核核小体和核小体有影响,用富集原理得出具有富集功能的KEGG pathway,发现类叶牡丹有效部位主要影响了细胞的营养物质的代谢(类固醇、糖类、氨基酸、维生素等物质的代谢与合成),还影响了 NF-κB信号通路、MAPK信号转导通路、TNF信号通路等炎性通路,类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫疾病的通路,VEGF信号血管通路,Wnt信号通路、Jak-stat信号通路等骨细胞通路及细胞凋亡通路、细胞癌通路等通路。通过qPCR验证芯片筛选出的差异基因,结果表明,类叶牡丹有效部位较模型组能显著增加Hist1h2ba、Egr1、Ccl3的mRNA表达,降低Hist1h2bj、Zfp36、Cxcl2的mRNA表达,与芯片数据一致,可能成为治疗RA的新靶点。结论:类叶牡丹有效部位对于生物过程和细胞组成影响较大,影响蛋白DNA复合物的组装、核小体组装、染色质组装与分解、DNA合成、DNA构象变化、蛋白聚合细胞白细胞介素-1响应,在细胞组成中主要通过调控组蛋白基因家族影响核核小体和核小体的组成,在分子功能上主要作用于趋化因子,包括趋化因子的活化、转移、与受体结合及其介导的信号通路的转导来影响RA,类叶牡丹有效部位用主要影响了细胞的糖类、脂类、蛋白类三大营养物质的代谢与合成,还参与调控NF-κB信号通路、MAPK信号转导通路、TNF信号通路等炎性通路,类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫疾病的通路,血管VEGF信号通路,Wnt信号通路、Jak-stat信号通路等骨细胞通路及细胞凋亡通路、细胞癌通路等。类叶牡丹有效部位可能通过调控炎性因子、组蛋白家族、趋化因子及其配体等与RA有关的细胞因子,对RA通路、TNF信号通路、Toll受体样信号通路、趋化因子信号通路等与RA病程相关的通路产生显著调控作用。
【学位单位】：黑龙江中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285
【部分图文】：
达的调控作用。包括以下几点：干扰其临近基因的表达；促使ＲＮＡ结合蛋白到基因逡逑启动子区，发挥调节功能；作为辅助因子对转录因子的活性进行调节；通过多种机制逡逑调节ＲＮＡ聚合酶］Ｉ的活性，实现对众多基因表达水平的调控［２３＿２５］，如图１－１。逡逑１．邋Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ逡逑Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ逡逑＊逦逦（■■■■逦 丨逦＿￣ｍｍ逦ｍｍｍｍ逦＆■■■逦＊逡逑逦５逦＾＾—ｒ—逡逑２．邋Ｉｎｄｕｃｅ邋ｃｈｒｏｍａｔｉｎ逦Ｉ邋Ｈｙｂｎｄｉｚｘｉｏｎ邋0ｉ逦？ｃＲＮＡ５ｂ灿逡逑ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ邋ａｎｄ逦Ｉ邋ｆｌｎｄａｎｔｉ＾ｎｓｅ邋ＲＮＡ％逦ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｐｍｔｅｉｎ逦■逡逑ｈｉｓｔｏｎｅ邋ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ逦＾逦＞邋ｆ逡逑%煎危福澹樱恚幔欤戾澹遥危铃义希校颍澹悖酰颍螅铮蝈义希恚恚椋椋殄危幔恚螅螅佩义希辏恚澹悖幔簦螅澹危恚幔螅簦礤义希澹苠义希拢欤铮悖脲澹颍澹悖铮纾睿椋簦椋铮铄澹铮驽澹澹铮铄澹劐危希椋悖澹蝈澹茫欤澹幔觯幔纾邋义希猓澹簦瑁邋澹螅穑欤椋悖澹铮螅铮恚邋危担澹停铮洌酰欤幔簦邋危罚澹粒欤簦澹蝈澹穑颍铮簦澹椋铄义希穑颍铮簦澹椋铄澹幔悖簦椋觯椋簦危欤铮悖幔欤椋幔簦椋铮铄义希
本文编号：2830505
【学位单位】：黑龙江中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285
【部分图文】：
达的调控作用。包括以下几点：干扰其临近基因的表达；促使ＲＮＡ结合蛋白到基因逡逑启动子区，发挥调节功能；作为辅助因子对转录因子的活性进行调节；通过多种机制逡逑调节ＲＮＡ聚合酶］Ｉ的活性，实现对众多基因表达水平的调控［２３＿２５］，如图１－１。逡逑１．邋Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ逡逑Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ逡逑＊逦逦（■■■■逦 丨逦＿￣ｍｍ逦ｍｍｍｍ逦＆■■■逦＊逡逑逦５逦＾＾—ｒ—逡逑２．邋Ｉｎｄｕｃｅ邋ｃｈｒｏｍａｔｉｎ逦Ｉ邋Ｈｙｂｎｄｉｚｘｉｏｎ邋0ｉ逦？ｃＲＮＡ５ｂ灿逡逑ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ邋ａｎｄ逦Ｉ邋ｆｌｎｄａｎｔｉ＾ｎｓｅ邋ＲＮＡ％逦ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｐｍｔｅｉｎ逦■逡逑ｈｉｓｔｏｎｅ邋ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ逦＾逦＞邋ｆ逡逑%煎危福澹樱恚幔欤戾澹遥危铃义希校颍澹悖酰颍螅铮蝈义希恚恚椋椋殄危幔恚螅螅佩义希辏恚澹悖幔簦螅澹危恚幔螅簦礤义希澹苠义希拢欤铮悖脲澹颍澹悖铮纾睿椋簦椋铮铄澹铮驽澹澹铮铄澹劐危希椋悖澹蝈澹茫欤澹幔觯幔纾邋义希猓澹簦瑁邋澹螅穑欤椋悖澹铮螅铮恚邋危担澹停铮洌酰欤幔簦邋危罚澹粒欤簦澹蝈澹穑颍铮簦澹椋铄义希穑颍铮簦澹椋铄澹幔悖簦椋觯椋簦危欤铮悖幔欤椋幔簦椋铮铄义希
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