碱蓬多糖的分离纯化、结构表征及其诱导MCF-7细胞凋亡的研究

发布时间：2020-09-30 01:24

　　 目的碱蓬(Suaeda salsa(Bunge))是一种一年生草本植物,其含有多种具有生物功能的大分子。本实验旨在优化碱蓬多糖(Suaeda salsa polysaccharide)的纯化工艺,建立其分离纯化方法,对其结构进行表征,并验证碱蓬多糖可诱导MCF-7细胞凋亡。方法以碱蓬为原料,采用水提醇沉法提取粗多糖。经Sevag法去除蛋白质以及活性炭吸附脱色后,通过DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-75凝胶柱进一步分离纯化碱蓬粗多糖,得均一组分SSP2-2。采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC,High-performance gel permeation chromatography)、PMP-柱前衍生高效液相色谱法(PMP-HPLC,PMP precolumn derivatization HPLC)、红外吸收分光光度法(IR,Infrared absorption spectrophotometry)、核磁共振波谱法(NMR,Nuclear Magnetic Resonance)对SSP2-2进行纯度验证及结构表征。通过MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)检测法、Hoechst33342染色法、流式细胞术(Flow cytometry)、线粒体膜电位检测法(MMP,Mitochondrial membrane potential)及蛋白质分子印迹法(Western blot)对SSP2-2诱导MCF-7细胞凋亡进行研究。结果SSP2-2重均分子量(M_w,Weight-average Molecular Weight)为53.8 kDa;PMP-HPLC显示SSP2-2主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖六种单糖组成,摩尔比为0.6:8.0:1.0:83.6:5.0:7.2;IR表明SSP2-2中含有糖醛酸、β-糖苷键等特征吸收。NMR表明SSP2-2为吡喃糖,并存在C-1连接。MTT提示SSP2-2对人乳腺癌细胞MCF-7具有显著的抑制作用;Hoechst 33342染色实验结果观察到SSP2-2引起MCF-7的细胞核出现皱缩、碎裂等特征;流式细胞仪结合Annexin V-FITC/PI染色法显示SSP2-2可以诱导MCF-7凋亡;线粒体膜电位检测显示SSP2-2导致MCF-7细胞线粒体跨膜电位降低,Western blot结果显示Bcl-2的蛋白表达降低,Bax、cytochrome C、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达增加,表明SSP2-2通过线粒体途径诱导细胞凋亡。结论本研究从碱蓬中提取分离纯化得到一种均一多糖组分SSP2-2。SSP2-2的分子量约为53.8 kDa,主要由半乳糖醛酸组成,SSP2-2通过线粒体途径诱导MCF-7细胞凋亡。
【学位单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R284.2;R285.5
【部分图文】：

图 1 葡萄糖标准曲线素实验用量对脱色效果的影响变情况下，设定活性炭用量为 1、2、2.5、3、3.5、色率呈先增加后降低的趋势，当活性炭加入量为 3性炭加入量超过 3%时，多糖脱色率明显下降，损失活性炭加入量过多而导致部分多糖被吸附，使脱碳不因此试验选择活性炭的添加量为 3%。651821

[32]。如图6-8所示，各图响应曲面坡度较陡峭，说明AD、BC和CD之间交互作用较强。通过图6可以看出，活性炭用量上升的幅度较pH稍陡峭，说明活性炭用量对多糖脱色率的影响较pH稍大。由图7可知，等高线图接近圆形，说明它们的交互作用并不明显。多糖脱色率随脱色温度和脱色时间的增加，先上升后缓慢下降，脱色温度的上升幅度明显比脱色时间的上升幅度陡峭，说明脱色温度对多糖脱色率的影响较大。图8可以看出脱色时间和pH对脱色率的影响均明显，鉴于曲面比较陡峭，等高线图是椭圆形，所以证明它们的交互作用也是明显的。固定pH不变时

如图6-8所示，各图响应曲面坡度较陡峭，说明AD、BC和CD之间交互作用较强。通过图6可以看出，活性炭用量上升的幅度较pH稍陡峭，说明活性炭用量对多糖脱色率的影响较pH稍大。由图7可知，等高线图接近圆形，说明它们的交互作用并不明显。多糖脱色率随脱色温度和脱色时间的增加，先上升后缓慢下降，脱色温度的上升幅度明显比脱色时间的上升幅度陡峭，说明脱色温度对多糖脱色率的影响较大。图8可以看出脱色时间和pH对脱色率的影响均明显，鉴于曲面比较陡峭，等高线图是椭圆形，所以证明它们的交互作用也是明显的。固定pH不变时，多糖脱色率随脱色时间的增加呈先上升后平缓下降的趋势。综合图8分析可知，脱色时间上升的幅度较pH稍陡峭，说明脱色时间对多糖脱色率的影响较大。

【参考文献】

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本文编号：2830542