苦楝提取的柠檬苦素类化合物抑制红白血病的机制研究

发布时间：2020-09-30 10:57

　　 目的:从中国药用植物苦楝中提取的一类柠檬苦素类化合物及结构与之相似的洋椿苦素,检测其在体外对红白血病细胞的抑制作用,及在体内对红白血病小鼠的治疗作用,并开展其具体作用机制的研究。方法:体外实验:1.筛选化合物:在药物库中通过MTT的方法筛选出一类具有抗白血病活性的化合物。2.测定细胞生长曲线:将HEL(人红白血病细胞)和CB7(小鼠红白血病细胞)按每孔约10~4个铺板于96孔板内,化合物分别作用0、24、48、72小时后加MTT培养4小时,然后用酶标仪检测吸光度值,并绘制细胞生长曲线。3.检测细胞凋亡:细胞铺板加化合物培养24小时后,置于流式细胞仪中检测细胞凋亡的情况。4.细胞周期和周期蛋白的表达:通过流式细胞仪检测周期阻滞、利用Western Blot进一步验证周期蛋白的变化。5.细胞分化及分化相关基因的变化:用流式细胞仪检测细胞分化的方向,并用实时荧光定量PCR进行验证。6.分子对接和MAPK/ERK通路:用电脑Autodock分析化合物和蛋白的结合位点,寻找化合物作用于红白血病的可能性靶点,用Western Blot检测MAPK/ERK通路中关键蛋白的表达。体内实验:1.动物模型的建立及分组:腹腔注射出生48小时内的Balb/c小鼠Friend病毒,建立红白血病小鼠动物模型,4-5周后将雌鼠和雄鼠分开,并随机进行分组,分为DMSO对照组和实验组。2.药物治疗:分组完成1周后给小鼠隔一天腹腔注射一次药物(3mg/kg),总共注射6次。3.取材及绘制生存曲线:给药完成后2周左右,一部分小鼠用于取脾脏、心脏血液及骨髓,记录数值,骨髓用于检测造血干细胞的变化比例;其他小鼠继续观察,待小鼠死亡后记录死亡时间,绘制生存曲线。结果:体外实验:1.筛选出3个柠檬苦素类化合物,分别为:12-hydroxyamoorastin、1-deacetylsendanin和29-iso-butylsendanin(编号:A1541、A1542、A1543)。2.细胞生长曲线显示A1541、A1542、A1543和洋椿苦素可以明显抑制红白血病细胞的生长。3.流式细胞仪检测结果显示化合物可以引起细胞凋亡。4.化合物可以导致周期阻滞,A1541、A1542、A1543导致G2期阻滞,但洋椿苦素是S期阻滞;但都可以使CDK2表达下调。5.这4种化合物根据细胞的不同引起不同的分化方向,A1541、A1543使HEL细胞发生巨核分化和红系分化,A1541、A1543和洋椿苦素促使CB7细胞只发生红系分化;与在基因表达层面的结果一致。6.分子对接结果显示这4种化合物作用于红白血病的可能靶点是ERK;在MAPK/ERK通路中,A1541、A1542、A1543使P-ERK和P-MEK都上调而洋椿苦素使之下调。体内实验:1.与DMSO组相对比,实验组小鼠的生存时间明显延长。2.小鼠的脾脏大小变化不明显。3.实验组小鼠的血细胞比容(Hct)升高。4.骨髓中造血干细胞比例增加。结论:柠檬苦素类化合物可抑制红白血病细胞生长,通过MAPK/ERK通路可能的靶点为ERK1/2,使HEL和CB7细胞发生凋亡、周期阻滞及诱导细胞分化,最终导致细胞死亡,这为进一步的临床应用及其他肿瘤的治疗提供了潜在的理论依据。
【学位单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285
【部分图文】：

且 A1541、A1542、A1543 和洋椿苦素的作用机制也是不同的，A1541、A1542、A1543 激活 P-ERK，而洋椿苦素则抑制 ERK1/2，但都导致红白血病细胞（HEL 和 CB7）发生红系和（或）巨核分化、细胞凋亡、周期阻滞，并且在体内都可以延长小鼠的生存时间。所以无论是 ERK1/2 的激动剂还是拮抗剂均可作为药物开发的新思路，用于治疗由 ERK1/2 驱动的白血病或其他癌症。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 柠檬苦素类化合物的化学结构如下图所示，该类化合物是在中国药用植物苦楝中提取的，其纯度达 98%以上。

15图 2-3 化合物 A1541、A1542、A1543 和 Cedrelone 的不同浓度对 HEL 和 CB7 细胞的抑制率Fig. 2-3 Inhibition rate of HEL and CB7 cells by different concentrations of A1541、A1542、A1543 and Cedrelone2.3 化合物导致红白血病细胞发生不同程度的凋亡上述的实验证实了化合物 A1541、A1542、A1543 和 Cedrelone 对白血病细胞具有较好的杀伤作用，接下来对于化合物以何种方式影响细胞的生长进行研究。结果发现化合物 A1541、A1542、A1543 的浓度为 0.5 μM 和 Cedrelone 浓度为的5 μM 时，作用 24 小时后能够明显引起 CB7 细胞的凋亡，HEL 细胞轻微的凋亡（见图 2-4）。HEL 细胞的凋亡率是从 DMSO 的 1.0%分别增加到加药后的 2.1%、

图 2-2 化合物 A1541、A1542、A1543 和 Cedrelone 抑制 HEL 和 CB7 细胞的生长Fig. 2-2 A1541、A1542、A1543 and Cedrelone inhibit HEL and CB7 cell growth

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本文编号：2830742