白果内酯对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的抗炎和免疫调节作用研究

发布时间：2020-09-30 09:37

　　目的:探讨白果内酯(Bilabolide,BB)的抗炎、免疫调节和髓鞘保护功效。方法:1.C57BL/6雌性小鼠经四点法皮下注射MOG诱导建立EAE模型,免疫后第三天给予BB腹腔注射给药至免疫后27天,记录临床评分。第28天处死小鼠,无菌取脾并分离脾单个淋巴细胞用于观察外周免疫反应,取脊髓观察中枢髓鞘病理变化。采用HE、LFB染色观察炎性细胞浸润和髓鞘脱失情况,免疫荧光染色观察炎性细胞浸润、小胶质细胞活化及其表型变化;ELISA观察脊髓组织和外周淋巴细胞促炎/抗炎细胞因子INF-γ、TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-6、IL-l0和TGF-β表达;Western blot观察脾单个核淋巴细胞和脊髓iNOS、Arg-1、TLR4、MyD88、NF-κB、Bax、Cleave-Caspase-3和Bcl-2的表达。2.运用LPS诱导BV2小胶质细胞建立炎症细胞模型,经BB干预后,MTT/CCK-8法观察细胞活力,ELISA观察炎性细胞因子NO、TNF-α和IL-1β的表达。3.C57BL/6雌性小鼠四点法皮下注射MOG肽,免疫9天后处死,无菌取脾并分离脾单个核细胞与MOG_(35-55)体外共培养。随后给予BB干预,培养48小时后经MTT法检测细胞活力,收集细胞和细胞液用于后续实验。ELISA测定培养液中促炎/抗炎细胞因子INF-γ、TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β的分泌情况,Western blot观察TLR4、MyD88和NF-κB的表达。结果:1.与EAE组相比,BB减轻了EAE小鼠疾病严重程度,延缓了EAE小鼠起病时间,EAE组为11.000±0.436天,BB20mg/kg组为13.710±0.738天,两组比较p0.01。HE和LFB染色显示,EAE小鼠脊髓炎细胞浸润量为1367±173.800,髓鞘累计光密度为64053±6529;BB20mg/kg组分别为176.500±49.870和80013±10470,两组比较差异显著,p值分别小于0.001和0.01,这表明BB减少了脊髓炎性细胞浸润和髓鞘脱失。2.EAE小鼠脊髓浸润大量的CD4~+T细胞(147.300±33.500)和CD68~+巨噬细胞(1226±160),而BB治疗组小鼠脊髓浸润的CD4~+T细胞(32.670±8.838)和CD68~+巨噬细胞(139.500±18.860)显著减少,p值分别小于0.001和0.01;与EAE组相比,BB抑制了MOG诱导的外周淋巴细胞的活化与增殖(p0.001);抑制了外周淋巴细胞炎性细胞因子的产生,INF-γ(p0.001)、TNF-α(p0.001)、IL-17(p0.05)、IL-6(p0.05)和iNOS(p0.05),提高了抗炎细胞因子IL-10和Arg-1的表达(p0.001)3.BB抑制了EAE小鼠TLR-NF-κB炎性信号通路。EAE组TLR-4的相对表达量为0.788±0.095,MyD88为0.377±0.024,p-NF-κB为0.265±0.028;相应的BB治疗组分别为0.542±0.096、0.148±0.027和0.081±0.012,两组比较p值均小于0.01。BB也降低了炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的表达(p0.05);同时,促进了抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的表达(p0.05)。4.BB促进了活化的小胶质细胞从M1型向M2型转化。与EAE组相比,BB显著抑制iNOS的表达(p0.001),同时显著上调了Arg-1的表达(p0.05)。EAE组Iba-1~+iNOS~+细胞数为55.670±5.783,BB治疗组为28±2.082,两组比较p0.01;EAE组Iba-1~+Arg-1~+细胞数为22.330±4.702,BB治疗组为40.330±6.333,两组比较p0.05。5.BB减少了LPS诱导的BV2小胶质细胞炎性细胞因子NO、TNF-α和IL-1β的释放(p0.05)。与LPS组相比,BB20μg/ml显著促进了LPS诱导的BV2小胶质细胞的增殖(p0.05)6.BB抑制了凋亡蛋白Bax、Cleave-Caspase-3的产生(p0.01),但提高了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(p0.05)。EAE组CD4~+C-Caspase-3~+细胞数为95.670±12.440,BB治疗组为8.667±2.028,两组比较p0.001;BB通过抑制凋亡蛋白,上调抗凋亡蛋白,显著促进了CNPase~+少突胶质细胞的存活(p0.01)。7.BB抑制了致脑炎淋巴细胞的炎症反应。与EAE组相比,BB压制了MOG特异性致脑炎淋巴细胞的增殖(p0.05);抑制了炎性细胞因子NO、INF-γ、IL-1β、IL-6和IL-17的表达(p0.05);抑制了TLR-NF-κB炎性信号通路。结论:BB能够有效缓解EAE小鼠的临床症状,减少髓鞘的脱失。体内和体外实验证实,BB的治疗作用与抑制TLR-NF-κB炎性信号通路有关,表现为BB抑制炎性反应(下调促炎细胞因子和上调抗炎细胞因子)、抑制MOG特异性淋巴细胞增殖,以及调节外周免疫反应、抑制小胶质细胞活化及调节其表型向抗炎的M2型极化,抑制凋亡蛋白产生等。
【学位单位】：山西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R-332;R285.5
【部分图文】：

小鼠,髓鞘,组织病理学,动物实验

改善了 EAE 小鼠的病情。由于 EAE 组与 BB（10 mg/kg）治疗组之间不存在数据上的差异，因此在接下来的动物实验中，选择给药剂量为 20mg/kg 的 BB 治疗组继续实验。通过组织病理学分析（图1b和1c），EAE组小鼠脊髓炎细胞浸润量为1367±173.800，BB 治疗组为 176.500±49.870，两组比较 p<0.001；EAE 组小鼠髓鞘累计光密度为64053±6529，BB 治疗组为 80013±10470，两组比较 p<0.01。这表明 BB 显著抑制了炎性细胞浸润，保护了髓鞘。

模式图,巨噬细胞,抗体,脾脏

13图 2 BB 改善了脊髓炎症损伤）脊髓的切片用 anti-CD4 和 anti-CD-68 抗体孵育，CD68+巨噬细胞和 CD4+T 细胞代表性两个研究员在荧光显微镜下观察并拍摄，每组 3 只小鼠，比例尺为 50μm；脊髓模式图于图示的免疫荧光染色区域。实验结束时，从各组所有小鼠的脾脏分离单个核淋巴细胞G35-55或不加 MOG35-55孵育脾单个核淋巴细胞。（b）细胞活力测定采用 CCK-8 法。统计双因素方差分析，然后进行 Bonferroni 检验。（c） ELISA 法检测相关的细胞因子。统用单因素方差分析，然后进行 Tukey - Kramer 检验（。d）脾脏 MNCs 裂解产物进行 SDS-，免疫印迹数据显示各组 iNOS 和 Arg-1 蛋白水平。数据表示为平均值±S.E.M（*p < 0.05.001 vs. EAE 组）。

炎症反应,脊髓,小胶质细胞,神经炎

3.3 BB 抑制 CNS 的炎症反应活化的小胶质细胞的一个重要效应细胞，可以分泌促炎和抗炎细胞因子和趋化因子，在神经炎症过程中这些因子的表达显著增加[32]。激活小胶质细胞可通过TLR4/MyD88/ NF-κB 等信号通路诱导靶细胞炎性基因表达[33]。因此，严格调控这些信号级联对于预防慢性神经炎症至关重要。我们首先通过 Western blot 检测脊髓中TLR4/MyD88/ NF-κB 信号蛋白的变化。EAE 组 TLR-4 的相对表达量为 0.788±0.095，MyD88 为 0.377±0.024，p-NF-κB 为 0.265±0.028；相应的 BB 治疗组分别为 0.542±0.096、0.148±0.027 和 0.081±0.012。如图 3a 所示，与 EAE 小鼠相比，BB 治疗组 TLR4、MyD88、p- NF-κB p65 的表达水平明显下降（p<0.01）。随后，用 ELISA 测定了在脊髓蛋白中表达的与小胶质细胞相关的典型的促炎细胞因子 IL-1β 和 TNF-α 和抗炎性细胞因子IL-10 及 TGF-β（图 3b）。我们注意到 BB 的治疗导致了 TNF-α 的明显下降（p<0.05），同时引起了 IL-10 和 TGF-β 显著增加，p 值分别小于 0.01。尽管无统计学差异，IL-1β的表达水平也显示出类似的下降趋势（图 3b）。

【参考文献】