重楼皂苷Ⅰ诱导ROS蓄积介导结肠癌细胞周期阻滞和自噬的研究

发布时间：2020-09-30 11:30

　　目的:探讨重楼皂苷Ⅰ对人结肠癌HCT116细胞的影响,并研究其潜在的作用机制。方法:1.采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测重楼皂苷Ⅰ对HCT116细胞的体外活性抑制,观察不同浓度重楼皂苷Ⅰ对HCT116细胞的生长抑制作用,计算半数抑制率(IC_(50));2.采用Hoechst33258染色法观察梯度浓度(0.5,1,2μg/ml)重楼皂苷Ⅰ对HCT116细胞核形态及数量的影响;3.采用流式细胞仪检测梯度浓度(0.5,1,2μg/ml)重楼皂苷Ⅰ对HCT116细胞周期的影响;4.采用细胞免疫荧光和激光扫描共聚焦显微镜检测重楼皂苷Ⅰ对HCT116细胞微管的影响;5.采用自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)转染法检测重楼皂苷Ⅰ对HCT116细胞自噬的影响;6.采用激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪检测重楼皂苷Ⅰ处理细胞后对ROS产生的影响;7.采用CCK8法检测使用自噬抑制剂3-MA及活性氧抑制剂NAC预处理细胞后,再使用重楼皂苷Ⅰ对细胞活力的影响;8.采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测重楼皂苷Ⅰ对HCT116细胞中细胞周期相关蛋白p21,p27,cyclinB1,CDC2,CDC25C,P-CDC25C等,细胞自噬相关蛋白LC3,p62,p-AKT,AKT,p-mTOR和mTOR的表达。结果:1.重楼皂苷Ⅰ以剂量-时间依赖方式抑制HCT116细胞的体外增殖,其24h,48h,72h的IC_(50)分别是1.91±0.27,0.93±0.025,0.79±0.03μg/ml;2.Hoechst 33258染色发现经(0.5,1,2μg/ml)重楼皂苷Ⅰ处理组细胞数量减少,双核细胞数量明显增加,差异具有统计学意义(P0.05,P0.01);3.经流式细胞仪检测发现,重楼皂苷Ⅰ处理细胞后可阻滞细胞周期在G2/M期;其中溶剂组G2/M期的比例是(23.07±1.65)%,给药组(0.5,1,2μg/ml)的比例是(30.7±2.05)%,(46.5±2.9)%,(51.6±3.45)%,差异具有统计学意义(P0.05,P0.01)。重楼皂苷Ⅰ未抑制G2/M期相关蛋白p21,p27,CDC2,CDC25C的表达和活性,相反却有促进作用;能够降低cyclinB1蛋白的表达;4.经2μg/ml的重楼皂苷Ⅰ处理后的细胞,与溶剂组相比,细胞微管结构紊乱;5.通过自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)转染HCT116细胞,经2μg/ml重楼皂苷Ⅰ处理后,观察到重楼皂苷Ⅰ能够诱导细胞产生自噬,且自噬蛋白LC3B-Ⅱ的表达升高,p62的表达降低,但是其上游通路蛋白P-AKT,P-mTOR蛋白的表达未发生明显的改变;自噬抑制剂3-MA预处理细胞后,再使用重楼皂苷Ⅰ处理细胞,其对细胞的抑制率明显低于相同浓度重楼皂苷Ⅰ单独处理组;6.重楼皂苷Ⅰ处理HCT116细胞后能够诱导细胞产生ROS;NAC预处理细胞后,再使用重楼皂苷Ⅰ处理细胞,其对HCT116细胞的抑制率明显低于相同浓度重楼皂苷Ⅰ单独处理组;7.重楼皂苷Ⅰ通过诱导HCT116细胞ROS蓄积,从而引起周期阻滞和自噬的产生。结论:重楼皂苷Ⅰ以剂量-时间依赖方式抑制HCT116细胞的生长,引起细胞微管结构紊乱,通过诱导ROS蓄积将细胞周期阻滞在G2/M期,引起细胞自噬。
【学位单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285
【部分图文】：

重楼,皂苷

图 1 重楼皂苷Ⅰ作用 24, 48, 72 h 对 HCT116 细胞的增殖抑制影响 Effect of Polyphyllin Ι on inhibition rate of HCT116 cells after 24, 48, 72 h

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图 2 重楼皂苷Ⅰ作用 HCT116 细胞 24 h 后对细胞核及细胞形态的影响（Hoechst33258, x400）Fig2 Effect of Polyphyllin Ι on nucleus and cell morphology of HCT116 cellsafter 24h （Hoechst33258, x400）

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各组的 G1%，S%的比例逐渐下降，G2/M %的比例逐渐升高，溶剂组与给药组 G2/M%的比例分别是(23.07±1.65)%，(30.7±2.05)%，（46.5±2.9)%，(51.6±3.45)%。结果表明，随着药物浓度的增加，重楼皂苷Ⅰ对 G2/M 期阻滞作用增强。差异有统计学意义（*P<0.05，**P<0.01)。见图 3，表 4。

【参考文献】