药物转运体MDR1和MDR3在乳腺癌多柔比星获得性耐药中的作用以及姜黄素的逆转功能研究

发布时间：2020-09-30 13:58

　　 研究目的:多柔比星是治疗乳腺癌一线化疗药物之一,但大多数患者在多柔比星使用过程中易发生获得性耐药现象,从而降低疗效。目前的研究表明,药物转运体表达与功能的变化与肿瘤细胞获得性耐药密切相关。姜黄素近年来被发现具有抗肿瘤的作用,可通过调控药物转运体增加多种化疗药物的敏感性。本研究拟观察ABC转运体超家族MDR1和MDR3在乳腺癌多柔比星获得性耐药中的作用,并探讨姜黄素对这些转运体介导的获得性耐药现象的逆转作用及其分子机制。研究方法:1.采用实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)和蛋白质免疫印迹法在乳腺癌多柔比星敏感性MCF-7细胞和多柔比星耐药性MCF-7/DOX细胞中筛选与多柔比星获得性耐药密切相关的药物转运体。2.MDCKⅡ单层细胞双向转运功能实验观察药物转运体MDR1和MDR3对多柔比星的转运功能;CCK-8法检测MDR1和MDR3对MCF-7和MCF-7/DOX细胞对多柔比星敏感性的影响;流式细胞术检测两种药物转运体对细胞内多柔比星累积的影响。3.亚硫酸氢盐测序法(bisulfitesequencingpcr,bsp)和染色质免疫沉淀技术(chromatinimmunoprecipitation,chip)观察dna甲基化和组蛋白乙酰化修饰对mdr1和mdr3表达的影响。4.cck-8法和流式细胞术检测姜黄素对mcf-7和mcf-7/dox细胞多柔比星敏感性及胞内蓄积浓度的影响。5.实时荧光定量pcr法和蛋白质免疫印迹法观察姜黄素对mcf-7和mcf-7/dox细胞中mdr1和mdr3表达的影响;bsp和chip法观察姜黄素对mdr1和mdr3基因dna甲基化与组蛋白乙酰化修饰的影响。6.mdckⅡ单层细胞双向转运实验观察姜黄素对mdr1和mdr3转运多柔比星功能的影响;atp酶活性实验观察姜黄素对mdr1和mdr3功能影响的机制。研究结果:1.与多柔比星敏感性mcf-7细胞相比,多柔比星耐药性mcf-7/dox细胞中药物转运体mdr1和mdr3在mrna水平的表达明显增加(4299.64±326.96)倍与(350.651±42.18)倍(p0.05),蛋白水平分别上调了(4.83±0.37)与(2.46±0.23)(p0.05)。2.mdr1和mdr3均对多柔比星具有转运功能,其转运动力学参数km值分别为(18.74±6.35)和(63.12±20.13)μm;vmax值分别为(400.78±120.45)和(194.18±89.62)nmol·min-1·mg-1。3.mdr1和mdr3蛋白表达水平与乳腺癌细胞多柔比星敏感性及多柔比星浓度呈反比。4.mdr1和mdr3在mcf-7/dox细胞中的表达上调与其基因启动子区dna低甲基化与组蛋白高乙酰化水平密切相关。5.姜黄素可以呈浓度、时间依赖性地显著增加mcf-7与mcf-7/dox细胞的多柔比星敏感性及胞内多柔比星蓄积浓度。6.姜黄素对mcf-7及mcf-7/dox细胞中mdr1和mdr3的表达水平有上调作用,该作用与降低mdr1和mdr3基因启动子区甲基化水平、升高组蛋白乙酰化水平密切相关。7.姜黄素对mdr1和mdr3介导的多柔比星外排功能有显著抑制作用,该作用与抑制两种转运体的atp酶活性密切相关。研究结论:abc家族药物转运体mdr1和mdr3对多柔比星均具有转运功能,并且其表达水平在乳腺癌mcf-7细胞多柔比星获得性耐药产生过程中明显升高;降低mdr1与mdr3的表达水平可以下调mcf-7和mcf-7/dox细胞内多柔比星的蓄积浓度,增加其药物敏感性;mdr1和mdr3表达上调与其基因启动子区甲基化和组蛋白乙酰化水平密切相关。姜黄素可显著增加乳腺癌细胞多柔比星敏感性及胞内蓄积浓度,主要与其抑制mdr1与mdr3的atp酶活性从而影响多柔比星的外排有关。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285
【部分图文】：

图 1.1 多柔比星耐药过程中 MDR1 和 MDR3 mRNA 水平变化Figure 1.1 Fold Changes of MDR1 and MDR3 mRNA levels after doxorubicin acquiredresistance注：n=3, *: P<0.05, 与对照组相比较。

图 1.2 多柔比星耐药过程中 MDR1 和 MDR3 蛋白水平变化 1.2 Fold Changes of MDR1 and MDR3 protein levels during the drug resisdoxorubicin注：n=3, *: P<0.05, 与对照组相比较。

MDR3 对多柔比星具有转运功能究了 MDR1 和 MDR3 对多柔比星的转运功能及其动力分别转染 MDR1 和 MDR3 基因的表达质粒构建过表1 和 MDCKⅡ-MDR3。如图所示，MDR1 和 MDR3 在 在 mRNA 水平分别上调（320.5±29.45）、（246.54±18.3，在蛋白质水平分别上调（2.45±0.29）、（2.04±0.18）倍明过表达模型构建成功，可进行下游功能实验。随后用实验观察 MDR1 与 MDR3 对多柔比星的转运功能。3 对多柔比星均具有转运功能，且两者对多柔比星转运其相应的转运速率分别为（400.78±120.45）和（1941，亲和力分别为（18.74±6.35）和（63.12±20.13）μM（

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本文编号：2830925