梅花鹿茸和花马杂交F1代鹿茸鉴别研究

发布时间：2020-09-30 17:43

　　鹿茸作为一种传统名贵药材,有极高的药用价值,但其质量评价和鉴别方法不尽完善,导致市场上难以分辨梅花鹿茸和花马杂交F1代鹿茸。本试验以梅花鹿茸和花马杂交F1代鹿茸为实验材料,从五种鉴别方法(含量分析、色谱鉴别、SDS-PAGE电泳鉴别、光谱鉴别、DNA分子鉴别)对梅花鹿茸和花马杂交F1代鹿茸进行比较试验,确定梅花鹿茸和花马杂交鹿茸F1代鉴别的最适方法,为实际生产和应用提供科学依据。含量测定分析:采用凯氏定氮法、高温干燥法、灼烧法、索氏提取法、分光光度法分别对两种鹿茸的蛋白质、水分、灰分、粗脂肪、磷脂含量进行了测定;采用原子吸收光谱法结合分光光度法测定了Ca、P、Na、K、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu无机元素的含量;采用电感耦合等离子体质谱法测定了As、Pb、Cd、Cr、Hg元素的含量;采用氨基酸分析仪结合分光光度法测定了两种鹿茸氨基酸的含量。使用spss分析软件进行统计分析。结果:梅花鹿茸粗灰分含量极显著高于花马F1代杂交鹿茸(P0.01),梅花鹿茸总磷脂含量显著高于花马杂交F1代鹿茸(P0.05)。梅花鹿茸K、Mn、Fe、Cu、Pb、Cd、组氨酸含量极显著低于花马杂交F1代鹿茸(P0.01)。梅花鹿茸Na、Hg、甲硫氨酸含量显著低于花马杂交F1代鹿茸(P0.05)。色谱鉴别:本实验按照2015版《中国药典》中相关规定,并综合薄层色谱法鉴别其他各种药材的方法,从薄层色谱条件,显色条件以及点样量方面优化处理,从而选择出鉴别的最适用方法,结果:两种鹿茸薄层图谱斑点无显著差异。运用高效液相色谱鉴别,色谱条件AgilentHCC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),以0.1%磷酸水溶液-甲醇(体积比30:70)和乙腈-0.1%磷酸水(体积比30:70)为流动相,流速0.5mL·min~(-1),检测波长280 nm,柱温25℃,进样量为20μL,梅花鹿茸在6min 300 mAU峰值的特征峰,在7min出现第二个峰,8min45s出现第三个峰值;而花马杂交F1代鹿茸仅在7min出现第一个峰值,8min45s出现第二个峰值。SDS-PAGE电泳鉴别:用水提取梅花鹿茸和花马杂交F1代鹿茸蛋白,利用SDS-PAGE电泳分析花鹿茸和花马杂交F1代鹿茸的蛋白差异。结果:梅花鹿茸和花马杂交F1代鹿茸的电泳图谱有明显区别,在12.5%、10.5%、7.5%分离胶系统中梅花鹿茸蛋白条带数均高于花马杂交F1代鹿茸,在10%、7.5%分离胶系统中,梅花鹿茸在116-97.2KD均出现条带,花马杂交F1代鹿茸均无条带。光谱鉴别:本文用紫外光谱仪扫描梅花鹿茸和花马杂交F1代鹿茸提取物190~400nm处波长,结果显示梅花鹿茸水提物紫外峰值出现在204nm处,而花马杂交F1代鹿茸紫外峰值出现在210nm处。在200nm处花马杂交F1代鹿茸水提物出现峰谷,梅花鹿茸在200nm处无此峰谷;用红外光谱仪扫描两种鹿茸4000~450cm~(-1)波长范围的光谱图。对两种鹿茸红外吸收峰进行分析,梅花鹿茸在3500~3000cm~(-1)有O-H伸缩振动有关的特征吸收峰,花马杂交F1代鹿茸在3500~3000cm~(-1)没有出现O-H伸缩振动有关的特征吸收峰。紫外光谱法和红外光谱法均可以区分梅花鹿茸和花马杂交F1代鹿茸。DNA分子多样性鉴别:本文采用随机扩增DNA多态性技术探索梅花鹿茸和花马杂交F1代鹿茸DNA多态性差异。采用血液组织细胞基因组提取试剂盒方法,提取梅花鹿茸和花马杂交F1代鹿茸DNA,选取20条随机引物,对两种鹿茸DNA进行扩增。PCR反应体系为2×Taq PCR Master Mix 12.5μL、随机引物1μL(12.5μmol·L~(-1))、DNA模板1μL(0.5μg)、无菌双蒸水10.5μL,总体系25μL。循环参数设置为:94℃预变性1min,94℃变形1min,45℃退火1.5min,72℃延伸1.5min,循环5次;94℃变性1min,50℃退火1.5min,72℃延伸1min,循环35次,72℃延伸5min,扩增产物在80 v琼脂糖电泳中跑30 min。得出随机引物电泳图谱,比较两种鹿茸20条引物扩增图谱差异。梅花鹿茸和花马杂交F1代鹿茸在引物1、4、5、9、11、16、17、18号引物中均没条带,在6、7、10、13、14、15、20号引物扩增产物均有的条带,花马杂交鹿茸在3号引物中有特异性条带3条,在12号引物中有特异性条带4条;梅花鹿茸在2号引物中有特异性条带1条,8号引物中有特异性条带3条,19号引物中有特异性条带4条。梅花鹿茸在同能扩增条带的7条引物中共有25条条带,而花马杂交F1代鹿茸有23条。花马杂交鹿茸F1代具有和梅花鹿茸相似的营养成分,有较高的研究价值,本研究为鹿茸的鉴别研究提供辅助依据;薄层色谱不能鉴别出梅花鹿茸和花马杂交F1代鹿茸差别,高效液相色谱鉴别分析范围广、分离能力强,分析时间快且定性分析结果可靠,可以很好的鉴别梅花鹿茸和花马杂交F1代鹿茸;聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨力较强、识别度较高,适用于从两种鹿茸的蛋白差异鉴别鹿茸种类;用光谱法测定鹿茸品种具有准确度高,精密度好的特点。RAPD技术多态性丰富、检出率高、技术简便,适用于鹿茸的快速鉴别,本实验中RAPD方法可以很好的将梅花鹿茸和花马杂交鹿茸鉴别区分,为梅花鹿茸和花马杂交鹿茸的鉴别提供了很好的遗传学依据。
【学位单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R282.5
【部分图文】：

梅花鹿茸,鹿茸,杂交F1代,条带

后先在 80v 电压下跑半小时，观察凝胶板下端有气泡向上冒出即样品中蛋白在通电环境中运动。待样品中的蛋白大分子都在分离胶与浓缩胶分层界面后（约半小时），调节电压至 120v，样品跑到胶板底部即可停止。电泳结束后，卸下硅橡胶框，用制造模孔的梳子轻轻撬开玻璃板，取出中间凝胶，将凝胶浓缩胶部分除去。放入培养皿中，加入考马斯亮蓝染色 3h。倒出考马斯亮蓝染色液，放入脱色液中脱色。脱色过夜，观察蛋白质条带。2.3 结果2.3.1 梅花鹿茸和花马杂交 F1 代鹿茸 12.5%分离胶电泳结果根据图 2-1 和表 2-2，在 12.5%分离胶系统中，梅花鹿茸出现 15 条带，117 KD以上有 3 条带，117-90 KD 出现 2 条带，90-49 KD 有 5 条带，49-35 KD 有 2 条带,35 KD 以下出现 3 条带；花马杂交 F1 代鹿茸出现 14 条带，区别与梅花鹿茸条带在 90-49 KD 出现 3 条带，49-35 KD 有 3 条带，其余与梅花鹿茸条带出现位置一致。

对比图,鹿茸,分离胶,电泳

分离胶,鹿茸,电泳条,条带

表 2-2 12.5%分离胶系统鹿茸蛋白分子量电泳结果5% separation gel system antler protein molecular weight electro≥117KD 117-90 KD 90-49 KD 49-35 KD 35-+ 3 + 2 + 5 + 2 +茸 + 3 + 2 + 3 + 3 +，-表示无条带。茸和花马杂交 F1 代鹿茸 10.5%分离胶电泳结果-2 和表 2-3，在 10%分离胶系统中，梅花鹿茸有 11 条200-116KD 有 2 条带，116-97.2KD 出现 1 条带，97.-44.3KD 有 3 条带，44.3KD 以下有 2 条带；花马杂交200KD 以上有 1 条带，200-116KD、116-97.2KD 没出现 1 条带，66.4-44.3KD 有 2 条带，44.3KD 以下有统蛋白条带差异显著。

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