丹参注射液体外对人软骨细胞和成骨细胞的生物效应实验研究

发布时间：2020-09-30 19:19

　　目的:考察丹参注射液对体外培养的原代人软骨细胞和成骨细胞的生物效应,探讨其治疗骨关节炎和骨质疏松的作用机理。方法:以丹参注射液丹参生药(1.5 mg· mL-1)作为计算药物浓度。软骨细胞药物分组:对照组、0.5、1.0、2.0、4.0 mg· mL-1。成骨细胞药物分组:对照组、0.5、1.0、2.0、3.0 mg ·mL-1。用指示细胞培养法(DNA染色法)检测人原代软骨细胞和成骨细胞是否有支原体污染;用RT-PCR法检测Ⅰ、Ⅱ型胶原基因的表达鉴定软骨细胞;用ALP活性检测和茜素红染色法染色钙结节鉴定成骨细胞;用MTT(Methylthiazole tetrazolium)法评价原代人关节软骨细胞(第3代)和成骨细胞hFOB1.19增殖活性;用荧光定量RT-PCR法测定软骨细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原基因的表达量,成骨细胞BMP-2、Runx2、OCN、COL1A1、BSP基因的表达量;用酶联免疫方法检测软骨细胞I、II型胶原的含量,成骨细胞I型胶原、OPN、OCN含量;用糖胺多糖试剂盒法检测软骨细胞总糖胺多糖的含量,评价软骨细胞的功能蛋白水平;用碱性磷酸酶试剂盒法检测成骨细胞内碱性磷酸酶活性。结果:1、支原体检测和细胞鉴定:结果显示,支原体阳性对照和阴性对照试验结果有效,人原代关节软骨细胞和成骨细胞无支原体检出;细胞检测出Ⅰ、Ⅱ型胶原基因的表达,说明细胞为软骨细胞。成骨细胞检测到ALP以及出现钙结节,说明细胞hFOB1.19具有成骨能力。2、软骨细胞生物效应研究:MTT实验结果显示,各浓度丹参注射液组的细胞相对活性均低于对照组,且降低趋势有量-效关系,提示丹参注射液对原代人关节软骨细胞有生长抑制效应;荧光定量RT-PCR结果显示,各浓度组细胞I型胶原mRNA表达量均低于对照组,且有一定的量-效关系;I型胶原蛋白检测结果显示,低剂量(≤2.0 mg ·mL-1)组可显著抑制I型胶原表达。这些结果提示低剂量的丹参注射液可能对原代人关节软骨细胞的脱分化有一定的抑制作用。同时,低剂量丹参注射液(≤4.0 mg ·mL-1)能促进糖胺多糖的含量增加,提示低剂量丹参注射液有促进软骨形成的生物效应。3、成骨细胞生物效应研究:MTT结果显示,4.0、6.0、8.0、10.0 mg· mL-1浓度的丹参注射液的成骨细胞相对活性均低于对照组,且降低趋势有量-效关系。低剂量(4.0 mg·mL-1 组对成骨细胞增殖无影响;荧光定量RT-PCR检测结果显示,给药3 天时,2.0mg·mL-1 组上调了 BMP-2、Runx2、OCN、COL1A1、BSPmRNA 的表达。给药7天时,对各基因表达与对照组相比没有显著性差异;碱性磷酸酶结果显示,作用3天时,各浓度组均可促进碱性磷酸酶活性,作用7天时,对碱性磷酸酶活性与对照组相比没有显著性差异;ELISA检测结果显示,作用3天时,2.0 mg ·mL-1组可促进[型胶原蛋白含量,2.0、3.0 mg· mL-1组可促进OCN含量,0.5、1.0、2.0 mg·mL-1组OPN含量与对照组相比无显著性差异。结论:1、人原代关节软骨细胞和成骨细胞hFOB1.19没有支原体污染。细胞分别鉴定为软骨细胞和成骨细胞。2、低剂量的丹参注射液可轻微抑制人第3代关节软骨细胞的增殖,抑制I型胶原(脱分化指标)的形成和促进糖胺多糖的合成,提示其具有促进软骨形成的生物效应。3、在不影响成骨细胞增殖的情况下,一定浓度丹参注射液可促进BMP-2、Runx2、OCN、COL1A1、BSPmRNA的表达,及碱性磷酸酶活性、I型胶原蛋白、OCN含量。提示其具有促进成骨细胞分化和诱导成骨效应。
【学位单位】：福建中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【文章目录】：
英文缩略词表
中文摘要
Abstract
前言
第一章细胞质量评价
    第一节细胞支原体检测
        1 材料与仪器
            1.1 试剂和材料
            1.2 仪器设备
        2 方法
            2.1 样品及试剂的制备
            2.2 指示细胞的制备
            2.3 接种
            2.4 染色及检测
        3 结果
        4 结论
    第二节软骨细胞和成骨细胞鉴定
        1 材料与仪器
            1.1 材料与试剂
            1.2 仪器
        2 方法
            2.1 原代人关节软骨细胞分离和培养
            2.2 RT-PCR检测软骨细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原基因
            2.3 人成骨细胞培养
            2.4 成骨细胞钙结节染色
            2.5 成骨细胞碱性磷酸酶检测
        3 结果
            3.1 软骨细胞形态
            3.2 软骨细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA检测
            3.3 钙结节染色
            3.4 ALP检测
        4 结论
第二章丹参注射液体外对原代人软骨细胞的生物效应实验研究
    1 材料与仪器
        1.1 材料
        1.2 仪器
    2 方法
        2.1 MTT实验
        2.2 荧光定量RT-PCR
        2.3 ELISA方法检测Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白含量
        2.4 糖胺多糖的检测
        2.5 统计学分析
    3 结果
        3.1 对软骨细胞增殖的影响
        3.2 mRNA表达水平
        3.3 丹参注射液对Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白含量的影响
        3.4 丹参注射液对糖胺多糖含量的影响
    4 讨论
第三章丹参注射液体外对人成骨细胞的生物效应实验研究
    1 材料与仪器
        1.1 试剂
        1.2 仪器
    2 方法
        2.1 MTT实验
        2.2 碱性磷酸酶检测
        2.3 qRT-PCR检测细胞各指标mRNA
        2.4 ELISA方法检测各指标的含量
        2.5 统计学分析
    3 结果
        3.1 不同浓度SMI对成骨细胞增殖影响
        3.2 实验成骨细胞ALP含量
        3.3 qRT-PCR检测各指标的熔解曲线
        3.4 qRT-PCR检测各指标的扩增曲线
        3.5 qRT-PCR检测各指标mRNA表达量
        3.6 ELISA法检测Ⅰ型胶原、OPN、OCN含量
    4 讨论和结论
第四章全文总结和展望
    1 总结
    2 展望
参考文献
文献综述
    参考文献
致谢
作者简历

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