研究背景及目的:氧化应激损伤是心血管疾病的一个重要的致病因素。缺血缺氧导致心肌细胞产生大量的活性氧自由基(ROS)。而活性氧在控制血管内皮功能、血管张力以及诱导心肌细胞肥大、增殖、凋亡、迁移等病理生理过程中有着重要作用。鼠李素是具有较高的生物活性的黄酮类化合物之一,其对心肌氧化应激损伤具有保护作用,但是关于其发挥作用的分子生物学机制的研究较少,因此本研究的主要目的是采用RNA-Seq分析技术和多种生物信息学方法来揭示鼠李素保护心肌氧化应激损伤的分子机制,为临床治疗提供新的作用靶点。方法:通过H_2O_2诱导大鼠心肌细胞H9C2,建立损伤模型。H_2O_2处理H9C2细胞作为对照组,H_2O_2处理+鼠李素给药为处理组,提取RNA并进行转录组测序,并根据测序结果进行以下分析:(1)筛选差异表达基因与构建相互作用网络。采用NOISeq数据分析包计算差异表达基因,设置筛选条件为:P value0.05及|log2FC|2。基于Gene ontology数据库以及KEGG通路数据库对差异表达基因进行功能以及通路富集分析。基于String数据库信息,建立蛋白互作(PPI)网络,设置条件:combined score不低于0.9。基于Cytosape插件MCODE进行子网络模块挖掘,阈值设置:Degree Cut off=2,Node Score Cutoff=0.2,K-Core=2,Max.Depth=100。(2)差异表达基因数据的深度挖掘。基于miRWalk2.0工具检索差异表达基因的调控miRNA,并利用R软件包clusterprofiler对miRNA进行KEGG功能富集分析。基于miRBase,miranda工具筛选score180的miRNA-lncRNA关系对。ceRNA以及miRNA-TF-gene网络中差异基因的GO-BP功能和KEGG富集运用DAVID工具来分析。运用WebGestalt网站对差异表达基因转录因子进行预测。基于DGIdb药物预测受miRNA和TF调控的关键差异基因的Drug-gene互作关系对。基于软件Cytoscape构建miRNA-gene,miRNA-lncRNA,ceRNA,TF-gene,miRNA-TF-gene以及Drug-gene互作关系网络。(3)差异表达基因的qPCR验证。基于生物信息学预测出的差异表达基因,筛选上调表达基因(NOTCH3,NUMBL,BCL2L11)和下调表达基因(PPP6C,MAPK1),通过qPCR方法检测其在大鼠心肌细胞H9C2对照组(H_2O_2处理)和实验组(H_2O_2处理+鼠李素给药)中的表达差异情况。结果:(1)通过比较对照组(H_2O_2处理)和实验组(H_2O_2处理+鼠李素给药)的表达数据,共获得1452个差异表达基因,其中对应上调和下调基因分别为703个和749个。GO功能富集分析结果显示,差异表达基因涉及的生物进程主要包括细胞或大分子代谢、细胞周期或细胞分裂、代谢或信号通路的调控、信号通路等。KEGG通路富集分析主要涉及的关键信号通路包括细胞粘着连接,Notch信号通路、氧化磷酸化、蛋白水解等。PPI网络共包括609个节点,并得到了2个score6的子网络模块,其中模块1涵盖了17个节点,并富集在mRNA降解、翻译、蛋白质定位相关的功能上;而模块2涵盖15个节点,主要富集于细胞分裂过程相关功能上。(2)通过对差异表达基因做聚类热图分析显示,实验组和对照组之间差异明显。差异表达基因调控miRNA的预测共获得189个miRNA以及577对miRNA-gene调控关系对。其中较为关键的miRNA主要包括miRNA-349,miR-211-5p以及miR-17-5p等。KEGG通路富集显示预测得到的miRNA显著富集到75个通路中,其中AMPK及PI3K-Akt信号通路富集的miRNA最多。通过对miRNA-gene调控关系作图,共获得120个节点和216个互作关系对。基于已有的miRNA对其调控的lncRNA进行预测共获得475个miRNA-lncRNA关系对。ceRNA网络中共有74个miRNA,90个mRNA以及60个lncRNA,其GO功能和KEGG通路富集分析结果显示,主要涉及的生物学过程包括RNA聚合酶II启动子转录的正调控(GO:0045944),凋亡负调节过程(GO:0043066)以及转录正调控(GO:004589)等过程;主要涉及的关键信号通路包括肾上腺素以及Notch等信号通路。此外,对差异表达基因相关的调控转录因子进行预测,共获得9个转录因子(PAX4,ELK1,ETS2,NRF1,GABP,E4F1,CACBINDINGPROTEIN,AP2ALPHA以及AP2GAMMA)。进一步地,通过构建miRNA-TF-gene调控网络整合得到241个调控关系对,且功能富集和通路富集分别富集到145个GO-BP结果和52个KEGG通路,富集结果与ceRNA网络基本一致。最后,我们对drug-gene互作关系进行预测并构建网络,结合富集生物学过程分析的与药物反应相关的基因分析发现基因BCL2L1,DNMT3A,HDAC2,STAT3等基因为重要的药物小分子基因。(3)qPCR结果显示,与对照组相比鼠李素处理组中的NOTCH3、MAPK1基因表达水平显著性下调(P0.05),BCL2L11基因表达显著性上调(P0.05),而上调基因BCL2L11与下调基因MAPK1表达趋势与前期预测结果相符,但差异不显著(P0.05)。结论:总的来说,本研究采用转录组测序技术对鼠李素对心肌氧化应激损伤保护作用的分子机制进行了研究。通过对心肌细胞鼠李素处理组以及对照组分析获得关键差异表达基因包括COX6A2,NDUFA2,UBA52,CDK1,MAPK1,Klf9以及NAA15;重要的miRNA包括miR-211-5p以及miR-17-5p;重要的转录因子包括ELK1及PAX4等;重要的信号通路包括Notch,AMPK以及PI3K/Akt信号通路;重要的药物小分子基因包括BCL2L1,DNMT3A,HDAC2以及STAT3。同时,该研究构建了一系列调控网络关系图,系统阐述了鼠李素对心肌氧化应激损伤保护作用过程中不同作用因子之间的相互作用关系,这也将为今后的研究提供重要的依据。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285
【部分图文】：
转录组测序的流程图
第 2 章 使用 RNA-seq 数据分析鼠李素在心肌氧化应激损伤中的保护作用及机制果NA 质量控制琼脂糖凝胶电泳组和对照组的细胞进行总 RNA 提取，后进行琼脂糖凝胶电泳检测，可见 18S、28S 条带清晰，且亮度比为 28S: 18S，约为 2: 1。这说明 浓度较高，无明显的降解，可用于构建 cDNA 文库进行 RNAseq 分
测序结果碱基组成情况
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 苏竟驰;;长柄鼠李的化学成分研究[J];Journal of Integrative Plant Biology;1988年01期
2 徐莉;;美国药典(24版):珀希鼠李(Cascara Sagrada)[J];国外医药(植物药分册);2003年04期
3 姜华;郭敏;沈敏娟;;藏药镰形棘豆中鼠李柠檬素对照品的制备[J];中国实验方剂学杂志;2012年17期
4 古秋莉;黄聪琳;张丽;姜华;;镰形棘豆中鼠李柠檬素抗炎作用研究[J];中国中医药信息杂志;2014年12期
5 王水潮;;藏药镰形棘豆中黄酮类成分山柰素和鼠李素的含量测定[J];时珍国医国药;2009年06期
6 颜卫东;孙霞;张洪云;孔庆国;;小叶鼠李的观赏价值及繁育技术[J];北方园艺;2009年04期
7 王娟;张春雨;赵秀海;邹璐;姜庆彪;丁胜建;;雌雄异株植物鼠李的生殖分配[J];生态学报;2011年21期
8 李惠明;鼠李育苗试验[J];河北林业科技;1990年02期
9 张欣;;鼠李果实色素的提取工艺研究[J];黑龙江畜牧兽医;2015年21期
10 李国霞;沈照鹏;江晓路;;绿藻硫酸鼠李聚糖酶性质研究[J];食品与发酵工业;2016年07期
相关会议论文 前7条
1 陈桂林;郭明全;;多靶标生物亲和超滤技术研究鼠李的多成分作用机制[A];第21届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集[C];2017年
2 叶晗;迟永洲;高健;王鹏;;硫酸鼠李多糖铬对Ⅱ型糖尿病小鼠的降血糖作用及机制研究[A];中国食品科学技术学会第十五届年会论文摘要集[C];2018年
3 苏邦瑛;孔凡作;吴萼;;取代2，6-二氧桥环[3，1，1]更烷类化合物：1，3-缩水-2．4-二氧苄基(和对溴代苄基)-β-L-鼠李吡喃搪的构象分析[A];第四届全国波谱学学术会议论文摘要集[C];1986年
4 柯文昌;;MECHANISMS OF RELAXANT ACTION OF 3-METHYLQUERCETIN IN ISOLATED GUINEA PIG TRACHEA[A];海峡两岸三地药理学学术报告会论文汇编[C];2001年
5 王顺春;方积年;;徐长卿多糖结构及其活性的研究[A];第四届中国新医药博士论坛论文集[C];1999年
6 李帅;陈若芸;于德泉;;三春水柏枝化学成分的研究[A];中药化学研究与药物创新——中华中医药学会中药化学分会2006年度学术研讨会论文集[C];2006年
7 姜华;胡君茹;詹文强;刘霞;;HPLC法测定藏药镰形棘豆中鼠李柠檬素的含量[A];甘肃省中医药学会2009年学术研讨会论文专辑[C];2009年
相关重要报纸文章 前1条
1 s
本文编号：2831317
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/zhongyaolw/2831317.html
