基于细胞自噬探讨活血定眩胶囊含药血清对bEnd.3细胞缺氧损伤的影响

发布时间：2020-10-02 10:04

　　目的:1.通过培养小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3细胞),研究在不同氧糖剥夺(OGD)模型时间下,bEnd.3细胞的增殖情况并选择最优OGD时间;2.在最优OGD时间下,探究不同浓度活血定眩胶囊含药血清对bEnd.3细胞的保护作用及与细胞自噬的关系,并完善活血定眩胶囊治疗椎动脉型颈椎病的作用机理,为活血定眩胶囊的进一步临床推广应用奠定基础。方法:1.取生长状况良好的bEnd.3细胞,传代后分为5组,分别为正常对照组、OGD 3h组、OGD 6h组、OGD 9h组和OGD 12h组。先将其放在正常二氧化碳细胞培养箱中培养36h后,再按照上述分组将细胞进行OGD处理。OGD处理方法如下,首先将无糖DMEM培养基置于37℃,5%C0_2、94%N_2、1%0_2及饱和湿度的三气细胞培养箱中低氧预处理30min。弃去各OGD组的旧培养基并置换成已低氧预处理的无糖DMEM培养基,然后将它们置于上述三气细胞培养箱中分别培养3h、6h、9h和12h。正常对照组即为OGD 0h组,因而在共培养36h后,将其培养液更换为无糖DMEM,并直接进行检测。运用普通光学显微镜观察bEnd.3的细胞形态并拍照,比较对照组与OGD各处理组中细胞形态的变化并使用CCK-8检测各组细胞活力。2.采用血清药理学理论方法制备活血定眩胶囊含药血清及空白血清。取生长状况良好的bEnd.3细胞,在同一代下分为7组,分别为模型对照组、不同浓度活血定眩胶囊含药血清OGD组(5%、10%、15%)、不同浓度空白血清OGD对照组(5%、10%、15%),先将其放在正常的二氧化碳细胞培养箱中培养,待细胞增殖到80%-90%密度时,再将各组的基础培养基更换为无糖DMEM培养基,其次根据各组分组方式不同加入相应的血清,其中模型对照组中不放任何血清,并根据上一部分的结果,所得到OGD最佳时间,将各组放入三气细胞培养箱中共培养OGD最佳时间后取出,吸取细胞培养基上清液,采用比色法检测细胞毒性时释放的乳酸脱氢酶(LDH)活性,采用硝酸根还原酶法检测一氧化氮(NO);利用流式细胞仪检测细胞凋亡率,运用Western Blot法检测各组自噬指标LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62、Beclin 1蛋白的表达,运用qPCR法检测各组P62及Beclin 1 mRNA的表达,综合以上结果分析活血定眩胶囊含药血清对bEnd.3细胞的保护作用及与细胞自噬的关系。结果:1.在光学显微镜下,正常对照组中bEnd.3细胞为长条状、梭型且分布规则,彼此相连,并呈丝网状有序排列,而在OGD模型组(3h、6h、9h及12h)中,随着时间的延长,bEnd.3细胞由原来的梭型逐渐往椭圆型发展,并在12h时,bEnd.3细胞大量死亡;通过CCK-8检测发现,与正常组比较,OGD模型组在4个时间点OD值均呈现下降趋势(P0.05),表明活随着时间的延长,bEnd.3细胞活力逐渐下降,并且结合光学显微镜结果,随着时间的推移,bEnd.3细胞凋亡率逐渐上升,且在OGD 12h时,细胞大量死亡。根据线性回归方程:y=-0.1186x+1.7375(R2=0.9881)可得,当活细胞占比为50%时,OGD诱导时间大约需要7.3小时,根据本实验结果,结合文献可得,在本实验中OGD诱导的最佳时间为6小时,确定6小时为OGD最佳时间。2.OGD诱导6小时后,与模型对照组相比,不同浓度含药血清组及不同浓度空白血清组均能在不同程度降低LDH的释放并增加细胞内NO分泌从而减轻由于OGD模型造成bEnd.3细胞损伤从,表明大鼠血清能够缓解细胞的损伤,并且降低细胞膜通透性;不同浓度空白血清组与不同浓度含药血清组相比,在相同剂量下,活血定眩胶囊含药血清均能显著抑制细胞上清液中LDH的增加,并增强NO的量从而保护细胞,10%、15%的活血定眩胶囊含药血清组差异显著(P0.05),其中10%含药血清组NO含量较其余各组最高,且差异显著(P0.05)。在凋亡检测中,我们发现模型对照组中bEnd.3细胞凋亡为35.5%。5%、10%、15%含药血清组中bEnd.3细胞凋亡率分别为18.4%、5.7%、11.2%;而5%、10%、15%空白血清组中bEnd.3细胞凋亡率分别为25.7%、20.7%、15.3%。同等剂量的含药血清组和空白血清组相比,各含药血清能够较好的抑制OGD诱导的bEnd.3细胞的凋亡率,且与其他各组相比,10%含药血清组能够明显抑制bEnd.3细胞凋亡的进程。Western Blot的结果可知:(1)与模型对照组相比,5%、10%、15%的含药血清组及5%、10%空白血清组中P62/β-Actin相对表达量均明显下降(P0.05),而15%空白血清组P62/β-Actin相对含量较模型对照组升高(P0.05),而10%含药血清组中P62/β-Actin相对表达量比其余各组都低(P0.05);(2)在LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的数据中我们可以发现,10%含药血清组较其他各组有明显升高(P0.05);5%、15%含药血清组中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值较5%、15%空白血清组有所上升(P0.05);(3)在Beclin 1/β-actin中,10%含药血清蛋白相对表达量较其他各组有显著性的上升(P0.05),5%药血清组中Beclin 1/β-actin的相对含量小于5%空白血清组(P0.05),而在15%含药血清组中,其含量高于15%空白血清组(P0.05)。qPCR结果表明:(1)含药血清组中Beclin 1 mRNA(BECN-1)的含量高于同等剂量的空白血清组;在P62mRNA中,空白血清组的表达量明显高于同等剂量含药血清组,(2)模型对照组中P62mRNA表达量降低而BECN-1的表达量上升。结论:1.在不同OGD时间诱导下,6小时为bEnd.3细胞最佳诱导时间2.活血定眩胶囊含药血清可显著对抗OGD诱导的bEnd.3细胞损伤,明显增强NO的含量,降低LDH的释放,减少bEnd.3细胞凋亡的数量,促进bEnd.3细胞增殖。3.活血定眩胶囊含药血清能够通过上调自噬相关蛋白Beclin 1、LC3及下调P62蛋白的表达,来减轻OGD诱导的bEnd.3细胞的损伤,从而调节血管内皮细胞的功能。
【学位单位】：甘肃中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

形态图,细胞的,形态,细胞

3）热循环设置为：预变性 95℃ 5min,变性 95℃ 30s,退火 60℃ 15s,延伸 72℃ 32s，共 40 循环，溶解曲线分析温度 60-95℃。记录 CT 值。3.统计学方法应用 SPSS21.0 软件，实验数据以均数±标准差（ ± S）表示，多组之间结果比较采用单因素方差分析。以 P<0.05 为具有统计学差异。4.实验结果4.1 镜下观察不同 OGD 时间诱导下 bEnd.3 细胞的形态正常组对照组中 bEnd.3 细胞呈梭型且分布规则，彼此间紧密相连，呈丝网状有序的分列；在光镜下，OGD 3h 组和 6h 组中 bEnd.3 细胞无明显、肉眼可见的变化；OGD 9h组中，bEnd.3 细胞由原来的梭型逐渐往多边型、椭圆型上发展，细胞整体呈膨胀状态，细胞间隙增宽，排列不紧密；bEnd.3 细胞 OGD 干预 12h 后，部分细胞死亡，培养基中漂浮着大量的死细胞。说明随着时间的推移，OGD 能够诱导 bEnd.3 细胞的损伤。

细胞活性,细胞缺氧,自噬,含药血清

基于细胞自噬探讨活血定眩胶囊含药血清对 bEnd.3 细胞缺氧损伤的影响5、图 2）表 5. 不同 OGD 时间对 bEnd.3 细胞活性的影响（ ± ，N=6）Table 5. Effect of different OGD time on the activity of bEnd.3 cells组别 OD 值活细胞占比（%） F 值 P 值常对照组 1.701±0.113 100%288.255 P<0.GD 3h 组 1.462±0.066*86%GD 6h 组 1.016±0.110*60%GD 9h 组 0.595±0.052*35%GD 12h 组 0.355±0.040*21%常组比较，*P<0.05

含药血清,血清组,空白,细胞缺氧

基于细胞自噬探讨活血定眩胶囊含药血清对 bEnd.3 细胞缺氧损伤的影响表 6. OGD 诱导的 bEnd.3 细胞中 NO 和 LDH 的结果（ ± ，N=3）Table 6. OGD-induced results of NO and LDH in bEnd.3 cells组别 NO（μmol/L） LDH（U/L）5%含药血清组 54.487±8.725*△473.783±13.545*△10%含药血清组 63.462±9.172*△360.674±11.731*△15%含药血清组 60.256±3.377*406.742±30.791*5%空白血清组 42.949±2.022△529.588±27.346△10%空白血清组 47.436±7.217*△472.659±18.946*△15%空白血清组 53.846±8.382*441.199±18.128*模型对照组 33.974±2.938 557.303±33.708注：*表示与模型对照组相比 P<0.01；△表示同等剂量的含药血清组与空白血清组相比 P<0.01（同）

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