酸杨桃根来源单体化合物DMDD抗胰岛素抵抗型糖尿病的研究

发布时间：2020-10-08 18:56

　　目的:1.探讨酸杨桃根中DMDD对棕榈酸诱导人骨骼肌细胞胰岛素抵抗及炎症因子的影响,为阐明DMDD是否可通过抑制TLR4信号转导途径改善骨骼肌细胞胰岛素抵抗提供理论依据。2.探讨酸杨桃根中DMDD对高脂高糖加STZ诱导TLR4基因敲除糖尿病模型小鼠胰岛素抵抗及炎性因子的影响,为阐明DMDD通过非TLR4信号转导途径改善糖尿病模型小鼠胰岛素抵抗的机制提供理论依据。方法:1.通过棕榈酸诱导人骨骼肌细胞(HSKMC)建立胰岛素抵抗细胞株模型,然后分组为:模型组(PA组)、阳性对照组(二十二碳六烯酸(DHA)干预组)、DMDD高、中、低剂量组(DMDD High、DMDD Mid和DMD Low干预组);正常HSKMC作为正常对照组(Normal组)。1.1采用MTT法检确定DMDD干预HSKMC细胞的合适浓度,PA诱导HSKMC的合适浓度,DHA干预HSKMC细胞的合适浓度;并通过葡萄糖浓度试验检测各组细胞对胰岛素的反应性。1.2 DMDD对HSKMC细胞炎症因子表达的影响:实时荧光定量RT-PCR法检测Toll样受体4(Toll-like Receptor,TLR4)、髓样分化因子(Myeloid Differentiation Factor 88,MyD88)、核因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-a,TNF-α)、白介素6(Interleukin-6,IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)mRNA的表达;Western Blot法检测TLR4、MyD88、细胞核磷酸化NF-κB p65(NF-κB p65)、TNF-α、MCP-1蛋白的表达。2.将6~8周龄的雄性TLR4敲除基因C57BL/10小鼠及TLR4野生型FVB小鼠按随机抽号的方法分成两组:正常饮食(Normal)组及高糖高脂饮食(HFHSD)组,HFHSD组采用高糖高脂高糖饲料喂养4周后进行STZ尾静脉注射造模,注射剂量按120 mg/kg进行注射。成功注射3日后尾静脉检测小鼠空腹血糖值、模型复制成功的标准为:血糖高于11.1mmol/L为造模成功糖尿病小鼠造模成功。将造模成功的小鼠进行分组,分为C57BL/10模型组(C57BL/10 Model group)组、吡格列酮组(PIO group)、DMDD低剂量(DMDD Low)组、DMDD中剂量(DMDD Mid)组、DMDD高剂量(DMDD High)组;同时设为:FVB正常组(FVB Normal group)、FVB对照组(FVB Control group)(予高剂量DMDD长期灌胃,作为长期毒性检测)、C57BL/10正常组(C57BL/10 Normal group)。每组10只小鼠。随后各组小鼠灌胃给药28天,DMDD低、中、高组、PIO组的给药剂量分别为:12.5、25.0、50.0、30 mg·kg~(-1);FVB对照组给予50.0 mg·kg~-11 DMDD;FVB正常组,C57BL/10正常组及C57BL/10模型组给予等体积的双蒸水;给药期间,每周称体重、隔周测FBG,给药28天后进行糖耐量试验(OGTT)、第35天进行胰岛素耐量试验(ITT)、第42天进行胰岛素释放试验(IRT),第49天,取血,处死小鼠,测量如下指标:2.1生化分析仪检测小鼠的血清中的总胆固醇(TC)、甘油三酯 (TG),低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶,(AST)、碱性磷酸酶(ALP);2.2酶联免疫吸附法(ELISA)测血清胰岛素(Insulin)、游离脂肪酸(FFA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、瘦素 (Leptin)、抵抗素(Resistin)及脂联素(ADP),计算胰岛素抵抗指数(IRI)、葡萄糖耐量(OGTT)、胰岛素耐量(ITT)、胰岛素释放试验(IRT);2.3 Real-Time PCR检测肝脏及胰腺组织中TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-6基因mRNA相对表达量;2.4 ELISA法检测肝脏组织中丙二醛(MDA)的含量、总超氧化物歧化酶(SOD)的活性;2.5 HE染色法观察肝脏组织及胰腺组织的病理变化;组织免疫化学法检测MyD88、NF-κB、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9,Bax、Bcl-2的表达;2.6电子显微镜观察小鼠胰腺及肝脏的变化;2.7 TUNEL法检测胰岛细胞及肝细胞的细胞凋亡。结果:1.与PA组比较,正常组,DHA组以及DMDD高,中,低剂量组培养液中的葡萄糖浓度明显降低,差异达到统计学显著性(P0.01),说明DMDD可以减少PA诱导HSKMC细胞的胰岛素抵抗;2.与PA组比较,DMD High组、DMD Mid组、DMD Low组、DHA组中的TLR4、MyD88、NF-κB、IL-6、TNF-α、MCP-1 mRNA的含量水平降低,差异均具达到统计学显著性(P0.05或P0.01),且呈剂量依赖关系;3.与PA组相比,DMD High组、DMD Mid组、DMD Low组、DHA组中的TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、MCP-1的蛋白水平均下调,差异均达到统计学显著性(P0.05或P0.01);4.与FVB正常组、C57BL/10正常组,FVB对照组中各项检测指标未见明显差异,即在本研究时限内DMDD对小鼠无毒性作用。5.与C57BL/10模型组比较,DMDD各剂量组小鼠的体重、FBG、TC、TG、LDL-C、ALT,AST及ALP的含量显著降低,而HDL-C增加,(P0.05,P0.01);6.与C57BL/10模型组比较,DMDD治疗组血清中的Insulin、FFA、TNF-α、IL-6、LEP、Resistin明显降低(P0.05,P0.01);7.肝脏组织中MDA的含量显著降低及SOD的活性明显提高,(P0.05,P0.01);8.RT-PCR结果显示,与FVB正常组,FVB对照组及C57BL/10正常组比较,肝脏及胰腺组织中的MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-6基因mRNA被上调(P0.05,P0.01);与C57BL/10模型组比较,经DMDD及吡格列酮治疗后,MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-6基因mRNA下调,(P0.05,P0.01);9.HE染色显示治疗组的肝脏脂肪变性明显改善;与C57BL/10模型组相比,经吡格列酮及DMDD治疗后,胰岛细胞的结构基本完整;10.透射电镜结果显示:经DMDD治疗后,模型小鼠肝组织线粒体损伤减少,内质网改进,线粒体增加;胰腺组织线粒体损伤减少,内质网改进,β细胞和分泌颗粒增加;11.免疫组化显示治疗组的肝脏及胰腺组织中的MyD88、NF-κB,凋亡相关蛋白Caspase-3、-8、-9及促凋亡蛋白Bax的表达显著减少(P0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2明显增多;与FVB正常组,FVB对照组及C57BL/10正常组比较,C57BL/10模型组中凋亡的胰岛细胞数明显增加(P0.01);与C57BL/10模型组比较,各治疗组的胰岛细胞凋亡数明显减少(P0.01)。结论:1.DMDD可能通过TLR4/NF-κB信号通路改善由PA所致人骨骼肌细胞的胰岛素抵抗。2.从研究结果得出DMDD长期使用未对小鼠涨生毒性作用。DMDD有可能避开TLR4受体而通过NF-κB转导途径改善糖尿病模型小鼠胰岛素抵抗,这也提示DMDD改善胰岛素抵抗机制的多靶点抑制。另外我们肯定的是DMDD通过降低FFA进而改善胰岛素抵抗,从而改善糖尿病模型小鼠高糖、高脂状态,其具体分子机制需要更进一步的研究。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

浓度,统计学意义,时对应,胞活性

图 1-1DMDD 安全给药浓度的确定（ ± s, n = 6）（与 Normal 组比较，**p<0.01Fig.1-1 The safe concentration of DMDD （ ± s, n = 6）（**p<0.01 vs Normal group4.2 PA 诱导人骨骼肌细胞给药的浓度以及二十二碳六烯酸( DHA ) 给浓度确定与正常组相比 100、200、400 μmol/L PA 组的人骨骼肌细胞活力下降，差异均有统计学意义（p<0.001），且呈剂量依赖性。一般选活性为 60-70%时对应的浓度为造模浓度，当 PA 浓度为 200 μmol/L 胞活性降至 58.67%左右。我们本次研究选择了 200 μmol/L 的 PA 浓度后续实验 PA 诱导人骨骼肌细胞损伤的浓度。具体结果表 3-2 和图 3-与正常组相比，100、200、400 μmol/L DHA 组的 200 μmol/L 的度诱导人骨骼肌细胞活力改变不明显，差异均有统计学意义（p<0.0一般选择细胞活性为 70-95%时对应的浓度为选择阳性浓度，当 DHA

细胞损伤,浓度,给药,抗胰岛素

酸杨桃根来源单体化合物 DMDD 抗胰岛素抵抗型糖尿病的研究 2018 届博士表 1-2 PA 诱导 HSKMC 细胞损伤的浓度以及 DHA 给药选择浓度（ ± s, n = 6）Tab.1-2 The concentration of PA induced HSKMC cell damage and the concentration of DHAselected（ ± s, n = 6）Group OD cell activity（%）Normal 0.14 ± 0.03 92.12 ± 11.93400 μmol/L DHA 0.14 ± 0.01 97.59 ± 17.45200 μmol/L DHA 0.13 ± 0.02 91.01 ± 13.27100 μmol/L DHA 0.11 ± 0.01 80.70 ± 13.71400 μmol/L PA 0.09 ± 0.02 42.11 ± 8.22**200 μmol/L PA 0.09 ± 0.02 58.67 ± 11.71**100 μmol/L PA 0.12 ± 0.05 78.22 ± 19.05与 Normal 组比较，**p<0.01

细胞损伤,浓度,葡萄糖,细胞的

DMDD 保护 PA 诱导的 HSKMC 细胞损伤的浓度确定（ ± s, n = 6）（与 Nop<0.01；与 PA 组比较，##p<0.01）3 Protection of DMDD on PA induced HSKMC cell damage（ ± s, n = 6）（*p<0s Normal group；，##p<0.01 vs PA group）糖测试正常组相比，PA 组葡萄糖浓度明显升高，统计学分析显示(P <0.01)；与 PA 组比较，正常组，DHA 组以及 DMDD 高，培养液中的葡萄糖浓度明显降低，统计学分析显示没有显著1)。说明 DMDD 可以减少 PA 诱导 HSKMC 细胞的葡萄糖4，图 1-4

【参考文献】