月华丸（胶囊）对耐多药结核菌感染自噬关键蛋白LC3、Beclin-1的影响

发布时间：2020-10-08 21:16

　　目的观察和探讨月华丸(胶囊)对耐多药结核菌感染单核巨噬细胞自噬关键蛋白LC3、Beclin-1的影响,从血清药理学及分子生物学角度,揭示其对耐多药结核菌感染巨噬细胞自噬的作用及其机制,为明确传统名方月华丸抗结核的效应提供实验依据。方法(1)月华丸(胶囊)含药血清的制备。以人与大鼠间按体表面积换算等效剂量,取3.02mg·kg-1的剂量,给大鼠每日灌胃1次,连续灌胃7天,经腹主动脉取血制备含药血清。(2)含药血清有效浓度测定。CCK-8法检测月华丸(胶囊)含药血清对小鼠单核巨噬细胞活性的影响,选取月华丸(胶囊)含药血清有效作用浓度。(3)按细胞:细菌=1:10构建细胞感染模型。(4)自噬关键蛋白LC3B、Beclin-1及其基因测定,以月华丸(胶囊)含药血清干预感染结核分枝杆菌的小鼠单核巨噬细胞,实验共分为5组:(1)阴性对照组;(2)10%月华丸(胶囊)含药血清组;(3)自噬抑制剂组:自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)+月华丸(胶囊)含药血清组;(4)自噬诱导剂组:雷帕霉素(Rep)组;(5)正常组:未被感染的细胞组。培养8小时后,采用间接免疫荧光法、Western blot、实时荧光定量RT-q PCR法检测LC3B蛋白、Beclin-1蛋白及其基因表达情况。结果(1)CCK-8检测月华丸(胶囊)含药血清对小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)活力作用表明,10%含药血清浓度时细胞增殖效果佳,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。(2)(1)间接免疫荧光测验显示:阴性对照组细胞胞浆中未见LC3B蛋白颗粒。与阴性对照组比较:10%月华丸(胶囊)含药血清组细胞胞浆LC3B蛋白颗粒明显增多;自噬诱导剂组细胞胞浆LC3B蛋白颗粒最多;自噬抑制剂组细胞胞浆中未见明显增多的LC3B蛋白颗粒。(2)Western blot显示:与阴性对照组、正常组、自噬抑制剂组比较,10%月华胶囊含药血清组、自噬诱导剂组细胞的Beclin-1、Beclin-1/β-actin比值均明显增加,Beclin-1蛋白表达增高,其差异的显著性有统计学意义(P0.05);阴性对照组、正常组、自噬抑制剂组细胞间各比值差异的显著性无统计学意义(P0.05)。(3)RT-q PCR显示:与正常组、阴性对照组、自噬抑制剂组含药血清组比较,10%月华丸含药血清组、自噬诱导剂组细胞中LC3、Beclin-1m RNA相对于内参基因的表达量值明显增加,LC3、Beclin-1m RNA表达均增高,其差异的显著性有统计学意义(p0.05);正常组、阴性对照组、自噬抑制剂组间各值比较,差异的显著性无统计学意义(p0.05)。结论(1)月华丸(胶囊)含药血清能促进小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)的增殖,对其活力有促进作用。(2)10%月华丸(胶囊)含药血清调控Beclin-1、LC3 m RNA及蛋白表达增高。证明月华丸(胶囊)能诱导被耐多药结核菌感染巨噬细胞自噬。检测耐多药结核菌感染上述蛋白表达变化有助于为耐多药结核提供新的治疗方法。
【学位单位】：湖南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

抗酸染色,结核分枝杆菌,形态,细菌

菌的培养菌株接种于补充有 10％OADC（油酸，白蛋白，葡％Tween-的 Middlebrook 7H9 肉汤中，37℃摇床培 PBS-0.05％Tween-80 中 4℃，5000 r·min-1 洗涤两培养基中。运用细菌麦氏比浊仪计算、调整细菌浓lebrook 7H9 液体培养基，配置 1×106CFU/m 菌悬液。

图2月华丸（胶囊）对巨噬细胞增殖的影响

菌感染,蛋白表达,胶囊,自噬

图 3. 各组多耐药结核菌感染 RAW264.7 细胞 LC3B 蛋白表华丸（胶囊）对耐多药结核菌感染 RAW264.7 细胞表达的影响药后 10%月华丸（胶囊）含药血清组及自噬诱导剂组中 Becli

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