乌头汤延缓膝骨关节炎大鼠软骨退变的作用与机制研究

发布时间：2020-10-09 01:53

　　目的探究乌头汤延缓膝骨关节炎大鼠软骨退变的抗炎作用机制,为乌头汤的临床应用提供实验支持。方法1.从网络药理学角度,分析乌头汤发挥抗炎镇痛作用的药效物质基础与作用机制。2.复制膝骨关节炎大鼠模型后,随机分为正常组、模型组、乌头汤组与对照组(双氯芬酸钠),进行干预后置于麻醉下取材,后经HE染色、透射电镜镜下观察软骨组织的形态学与软骨细胞超微结构变化;Western Blot法检测P38 MAPK、JNK、Ras、ERK、i NOS蛋白含量表达;酶联免疫吸附测定法检测滑膜组织中炎症因子IL-1β、TNF-α含量表达。3.软骨细胞体外培养体系的建立,甲苯胺蓝染色与Ⅱ型胶原染色进行软骨细胞的鉴定;使用倒置显微镜镜下观察软骨细胞形态;MTT法检测乌头汤对LPS诱导软骨细胞活性影响;酶联免疫吸附测定法分别检测软骨细胞上清液中NO、SOD的含量表达;RT-PCR、Western Blot分别检测各组软骨细胞与炎症信号通路相关的P38 MAPK、C-myc、C-fos、C-jun、Ras、ERK、i NOS、TNF-a、NF-κB p65、IKK、IκB基因与蛋白的含量表达。结果1.乌头汤中的主要有效成分涵盖生物碱类、黄酮类、皂苷类等化合物,可从p38MAPK、JNK、i NOS等信号途径发挥抗炎镇痛作用,为深入研究其防治KOA的分子机制提供思路。2.HE染色结果显示,乌头汤组、对照组(双氯芬酸钠)浅表层切线与关节面基本平行且完整,移行层、辐射层、钙化层及其他层次结构相对清晰可辨;透射电镜观察显示,乌头汤组、对照组(双氯芬酸钠)的软骨细胞外形变化较小,呈类圆形,外层微绒毛附着,细胞核较大,异染色质、糖原颗粒与椭圆状的线粒体散在分布,细胞器结构较为完整清晰;Western Blot结果显示,与正常组比较,模型组的P38 MAPK、JNK、Ras、ERK、i NOS蛋白含量均表达升高(P0.01),与模型组比较,对照组、乌头汤组的P38 MAPK、JNK、Ras、ERK、i NOS蛋白含量均表达降低(P0.05或P0.01);ELISA结果显示,乌头汤、对照组的滑膜组织中IL-1β、TNF-α含量表达均低于模型组(P0.01)。3.第2代软骨细胞形态一致、胞核可视且清晰,生长状态良好;经甲苯胺蓝染色后,软骨细胞胞内及其周围区域可见紫红色异染颗粒;经Ⅱ型胶原染色后,阳性对照组胞浆区呈棕黄色;MTT实验结果显示,乌头汤水提物对LPS诱导软骨细胞的最佳干预时间和浓度分别为24 h和150μg/m L;ELISA结果显示,与模型组比,乌头汤水提物组的NO含量表达低于模型组(P0.01),而SOD含量明显高于模型组,尤其以150μg/m L组变化显著(P0.01);RT-PCR、Western Blot法检测结果显示,乌头汤水提物各浓度组(100、150、200μg/m L)对LPS诱导的软骨细胞干预24 h后,均可改善与炎症信号通路相关的P38 MAPK、C-myc、C-fos、C-jun、Ras、ERK、i NOS、TNF-a、NF-κB p65、IKK、IκB基因与蛋白含量表达,尤其以乌头汤水提物150μg/m L变化显著(P0.01)。结论1.基于网络药理学研究表明乌头汤可通过多途径、多靶点发挥抗炎镇痛作用。2.乌头汤可改善膝骨关节炎大鼠关节软骨的形态结构,并下调关节软骨、滑膜组织中与炎症相关调节因子含量表达,延缓膝骨关节炎大鼠软骨退变。3.乌头汤通过降低LPS诱导的软骨细胞中与炎症相关调节因子含量表达,发挥抗炎作用。
【学位单位】：福建中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
引言
第一部分乌头汤发挥抗炎镇痛作用的网络药理学研究
    1 研究目的
    2 材料
        2.1 试验药物
        2.2 研究工具
    3 试验方法
        3.1 乌头汤的配体分子集建立
        3.2 乌头汤的化学空间构建
        3.3 乌头汤中发挥抗炎镇痛作用的化合物-靶点作用网络构建
    4 结果
        4.1 乌头汤的化学空间特征
        4.2 乌头汤中发挥抗炎镇痛作用的化合物-靶点作用网络
    5 讨论
        5.1 中药药效物质基础研究
        5.2 乌头汤药效成分研究
        5.3 乌头汤的药理作用研究
        5.4 从网络药理学研究乌头汤发挥抗炎镇痛作用的机理
    6 小结
第二部分乌头汤延缓膝骨关节炎大鼠软骨退变的抗炎机制研究
    1 研究目的
    2 实验材料
        2.1 实验动物
        2.2 主要试剂
        2.3 主要仪器
    3 实验方法
        3.1 药物制备
        3.2 动物分组、造模、干预、取材
        3.3 一般情况观察
        3.4 滑膜组织观察
        3.5 软骨组织HE染色
        3.6 透射电镜观察软骨细胞超微结构变化
        3.7 Western Blot检测关节软骨中p38MAPK、JNK、Ras、p-ERK1/2、iNOS蛋白含量表达
        3.8 酶联免疫吸附测定法检测关节滑膜组织中IL-1β、TNF-α含量表达
    4 统计学分析
    5 实验结果
        5.1 一般情况观察
        5.2 滑膜组织观察结果
        5.3 软骨组织HE染色结果
        5.4 透射电镜超微结构观察结果
        5.5 Western Blot结果
        5.6 ELISA检测结果
    6 讨论
    7 小结
第三部分乌头汤对LPS诱导大鼠软骨细胞炎症反应的影响
    1 研究目的
    2 实验材料
        2.1 实验动物
        2.2 主要试剂
        2.3 主要仪器
        2.4 主要实验用液配制
    3 实验方法
        3.1 乌头汤水提物的制备
        3.2 软骨细胞的分离、培养及鉴定
        3.3 LPS诱导软骨细胞致炎模型的复制
        3.4 MTT比色试验检测软骨细胞活性
        3.5 酶联免疫吸附测定法检测各组软骨细胞上清液NO、SOD含量表达
        3.6 RT-PCR法检测软骨细胞中p38MAPK、C-myc、C-fos、C-jun、Ras、ERK、iNOS、TNF-a、NF-κB p65、IKK、IκB mRNA含量表达
        3.7 Western Blot法检测软骨细胞中p38MAPK、C-myc、C-fos、C-jun、Ras、p-ERK1/2、iNOS、TNF-a、NF-κB p65、IKK、p-IκB蛋白含量表达
    4 统计学分析
    5 实验结果
        5.1 软骨细胞镜下观察
        5.2 甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化鉴定结果
        5.3 MTT检测结果
        5.4 ELISA检测结果
        5.5 RT-PCR检测结果
        5.6 Western Blot检测结果
    6 讨论
    7 小结
结论
参考文献
附录
文献综述
    参考文献
致谢
作者简历

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