基于免疫损伤探讨桂枝汤抗动脉粥样硬化的作用研究

发布时间：2020-10-09 01:56

【摘要】：目的动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是临床上常见的一种血管病变,是引起如冠心病、脑卒中等心脑血管系统疾病的病理生理基础和主要原因,严重威胁人类的生命健康和生活质量。本课题应用ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠,给予高脂饮食,复制AS动物模型,并采用桂枝汤进行干预,从短期干预和长期干预动态观察两个方面,研究和探讨桂枝汤对AS的调节机制,研究AS生物学基础,为临床治疗AS提供借鉴,并拓展桂枝汤临床应用范围。方法1.采用ApoE-/--小鼠,给予高脂饲料(高脂饲料含78.85%基础饲料、0.15%胆固醇、21%脂肪),复制AS动物模型。短期干预实验分为野生普食组、ApoE-/-普食组、ApoE-/-高脂组、阿托伐他汀组、桂枝汤组;长期动态干预实验分为野生普食组、ApoE-/-普食组、ApoE-/-高脂组、桂枝汤组。2.短期干预:桂枝汤干预4周后,每组小鼠随机分再为2组,一组进行LPS腹腔注射,刺激3h后采用CBA法检测各组小鼠血浆细胞因子表达水平;另一组直接取材检测:(1)常规生化检测各组小鼠血脂水平;(2)流式细胞术检测各组小鼠外周血粒细胞比例及其表面CD36和TLR4表达、单核细胞比例及其表面CD36和TLR4表达、单核细胞亚型的比例;(3)病理检测各组小鼠主动脉AS斑块的形成情况;(4)实时荧光定量PCR检测各组小鼠主动脉细胞因子的表达。3.长期动态干预:桂枝汤干预18周,分别于干预6周、12周、18周后取材检测:(1)检测每周各组小鼠体重变化;(2)常规生化检测各组小鼠血脂TC、LDL、HDL、TG水平,以及肝功能AST、ALT水平;(3)流式细胞术检测各组小鼠外周血粒细胞比例及其表面CD36和TLR4表达、单核细胞比例及其表面CD36和TLR4表达,以及单核细胞亚型比例;(4)悬液芯片技术检测各组小鼠血浆细胞因子 TNF-α、IL-6、MCP-1、IFN-γ、NOS2、IL-1β 的表达;(5)各组小鼠主动脉血管根部进行病理切片,HE染色、油红O染色,显微镜下观察主动脉管壁AS斑块的形成情况;(6)剥离主动脉血管,在体视镜下观察各组小鼠主动脉AS斑块形成情况;纵向剖开主动脉血管进行油红O染色,鉴定主动脉AS斑块形成情况;(7)实时荧光定量PCR技术检测各组小鼠主动脉血管组织中细胞因子表达。结果短期干预结果:1.与对照组比较,ApoE-/-普食组小鼠血浆HDL的表达显著降低(P0.01),TC、LDL的表达显著升高(P0.01),给予高脂可进一步升高TC、LDL的表达(P0.01)。2.与ApoE-/-普食组比较,ApoE-/-高脂组小鼠外周血中单核细胞比例及单核细胞表面TLR4受体的表达、Ly6C++单核细胞比例显著升高(P0.01),定居型Ly6C-单核细胞比例显著降低(P0.01);给予桂枝汤干预,可以显著降低模型组小鼠外周血单核细胞表面受体CD36、TLR4的表达,同时降低Ly6C++单核细胞比例,升高Ly6C-单核细胞比例(P0.01)。3.与ApoE-/-普食组比较,ApoE-/-高脂组小鼠外周血中炎症因子IL-12p70、TNF的表达水平显著升高(P0.01);与ApoE-/-高脂组比较,桂枝汤组小鼠外周血中IL-12、TNF、IFN-y的表达有下降趋势,但无统计学差异(P0.05)。4.在主动脉病理切片中可观察到,ApoE-/-高脂组小鼠主动脉血管检测到动脉粥样硬化的早期阶段脂纹。5.与ApoE-/-普食组比较,ApoE-/-小鼠高脂组小鼠主动脉IL-6、MCP-1、IL-lβ的表达显著升高(P0.01);桂枝汤短期干预可显著抑制模型组小鼠血管的IL-6、IL-1β、MCP-1、TNF-α等炎性细胞因子的表达;同时促进血管TGF-β、IL-10、Arg-1等抗炎细胞因子的表达(P0.01)。长期动态干预结果:1.与同周龄野生普食组比较,ApoE-/-高脂组小鼠的体重有增长趋势,桂枝汤干预后可降低小鼠体重,且在干预6周后,ApoE-/-普食组小鼠增重量显著高于野生普食组(P0.01)。2.与同周龄ApoE-/-普食组小鼠比较,ApoE-/-高脂6周、12周、18周组小鼠的TC、LDL的表达均显著升高(P0.01),与短期结果一致。3.18周高脂饮食对ApoE-/-小鼠的肝功能ALT和AST没有显著影响;同样,给予桂枝汤干预18周,ApoE-/-小鼠肝功能ALT、AST的表达也没有显著变化。4.与同周龄ApoE-/-普食组小鼠比较,ApoE-/-高脂饮食6周、12周、18周组小鼠外周血中单核细胞的比例显著升高(P值分别为P0.01、P0.05、P0.05),;桂枝汤干预后有降低趋势,但无统计学差异(P0.05)。5.与同周龄ApoE-/-普食组小鼠比较,ApoE-/-高脂6周组小鼠外周血中LyC6++的单核细胞比例有升高趋势(P0.05),ApoE-/-高脂12周、18周组小鼠外周血中LyC6++单核细胞的比例显著升高(分别为p0.01、p0.05);桂枝汤干预后均可显著降低比例(P0.01)。6.与同周龄ApoE-/-普食组比较,ApoE-/-高脂18周组小鼠外周血中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-lβ、MCP-1、M-CSF、IL-10 有升高趋势(P0.05);给予桂枝汤干预可抑制炎症因子升高。7.6周、12周、18周后,HE染色检测到ApoE-/-小鼠主动脉的进展性AS斑块;干预18周后,ApoE-/-高脂组小鼠主动脉主动脉内膜、中膜明显增厚,有大量脂质沉积,纤维斑块形成,基底膜破坏,油红O染色阳性;桂枝汤干预后可抑制AS斑块的形成、发展。8.6周、12周、18周后分别观察各组小鼠大体主动脉组织发现,野生普食组小鼠主动脉在体视镜下均未见明显斑块;随着干预时间的延长,可在体视镜下观察到ApoE-/-普食组小鼠主动脉管壁增厚,在干预12周后,在主动脉与头臂干、颈总动脉及锁骨下动脉分叉处可观察到白色的脂肪组织,18周后AS斑块面积增大,主动脉油红O染色结果与大体观察一致;ApoE-/-高脂组小鼠主动脉大体观察表明,高脂饮食可进一步增加ApoE-/-小鼠的AS斑块,且随时间的延长而加重;给予桂枝汤干预后则可明显减少小鼠主动脉斑块的面积。9.与同周龄ApoE-/-普食组比较,ApoE-/-高脂6周、12周、18周组小鼠主动脉炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1的表达显著升高(P0.01);给予桂枝汤干预后可以显著抑制ApoE-/-小鼠主动脉炎性细胞因子的表达(P0.01),同时也降低主动脉抗炎细胞因子TGF-β、IL-10的表达(P0.01)。结论高脂饮食导致ApoE-/-小鼠血脂水平升高,加速AS发生发展,加重机体免疫损伤。桂枝汤短期干预及长期动态干预可以降低高脂饮食的ApoE-/-小鼠全身炎症反应和主动脉血管局部的炎症反应,且对局部炎症反应的抑制作用强于全身炎症反应;桂枝汤调节炎症反应不依赖于血脂水平的改变;桂枝汤可抑制模型小鼠主动脉血管AS斑块的形成、发展,为临床AS的治疗用药及疗程提供借鉴。
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

中国中医科学院二0一四级硕士研究生学位论文逡逑实验结果逡逑１短期干预实验结果逡逑１．１桂枝汤对血脂水平的影响逡逑与野生普食组小鼠比较，Ａｐ0Ｅｖ？普食组小鼠血浆ＴＣ、ＬＤＬ水平显著升高逡逑（／＾Ｏ．Ｏｌ），ＨＤＬ水平显著降低（ＰＯ．０１）；与ＡｐｏＥｖ？普食组小鼠比较，ＡｐｏＥ－ｚ？高脂逡逑组小鼠血浆ＴＣ、ＬＤＬ水平显著升高（Ｐ＜０．０１）；与Ａｐ0Ｅｖ－高脂组比较，阿托伐组逡逑和桂枝汤组都没有显著改变血脂ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ和ＨＤＬ水平（Ｐ＞０．０５）。逡逑

图２流式细胞术检测外周血中粒细胞以及单核细胞、单核细胞亚型逡逑注：采用流式细胞术检测小鼠外周血中白细胞以及粒细胞、单核细胞、单核细胞亚型。逡逑Ａ表不根据前向侧角散射信号（Ｆｏｒｗａｒｄ邋Ｓｃａｔｔｅｒ，邋ＦＳＣ）和侧向侧角散射信号（Ｓｉｄｅ邋Ｓｃａｔｔｅｒ，邋ＳＳＣ）逡逑区分出外周血中白细胞，从下至上分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞三群；Ｂ表示根据细胞逡逑表面标记区分ＣＤｌｌｂ＋Ｇｒ－ｒ为单核细胞，ＣＤｌｌｂ＋Ｇｒ－ｌ＋为粒细胞；Ｃ表示根据单核细胞表面逡逑Ｌｙ６Ｃ的表达将单核细胞分为ＬｙＧＣ＇邋Ｌｙ６Ｃ＋、Ｌｙ６Ｃ－三群。逡逑１．３桂枝汤对外周血中粒细胞比例及其ＣＤ３６、ＴＬＲ４表达的影响逡逑Ｇ逦Ｇ－ＣＤ３６逦Ｇ－ＴＬＲ４逡逑６０－１逦１６－１逦６０－１逡逑Ａ逦Ｂ逦Ｃ逡逑ｒ逦ｉ１０＇＊逦W 媝逡逑

＊ｍ：邋ｕ逡逑0邋ｊ邋■逦■邋？邋｜￣ｉ—ｉ￣■邋｜邋■邋？邋■＜邋－Ｔ＇邋■［逦，0逦Ｉ邋ｉ￣ｍ？ｈ邋■邋■邋＇邋■邋■邋■邋ｌ＂？逦１0邋－邋■—ｔ—ｉＴＴｗｙ邋ｉｖｒ，ｐｗｙ，ｉ邋？邋ｉ｜Ｈ？ｊ逡逑０逦２００逦４００逦６００逦８００邋ＩＫ逦１０°逦１0１逦１０：逦１0３逦１0４逦１０°逦１０’逦１0：逦１0３逦１０＊逡逑逦＞邋逦＞邋逦＞逡逑ＦＳＣ逦Ｇｒ－１逦Ｌｙ６Ｃ逡逑图２流式细胞术检测外周血中粒细胞以及单核细胞、单核细胞亚型逡逑注：采用流式细胞术检测小鼠外周血中白细胞以及粒细胞、单核细胞、单核细胞亚型。逡逑Ａ表不根据前向侧角散射信号（Ｆｏｒｗａｒｄ邋Ｓｃａｔｔｅｒ，邋ＦＳＣ）和侧向侧角散射信号（Ｓｉｄｅ邋Ｓｃａｔｔｅｒ，邋ＳＳＣ）逡逑区分出外周血中白细胞，从下至上分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞三群；Ｂ表示根据细胞逡逑表面标记区分ＣＤｌｌｂ＋Ｇｒ－ｒ为单核细胞，ＣＤｌｌｂ＋Ｇｒ－ｌ＋为粒细胞；Ｃ表示根据单核细胞表面逡逑Ｌｙ６Ｃ的表达将单核细胞分为ＬｙＧＣ＇邋Ｌｙ６Ｃ＋、Ｌｙ６Ｃ－三群。逡逑１．３桂枝汤对外周血中粒细胞比例及其ＣＤ３６、ＴＬＲ４表达的影响逡逑

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本文编号：2833065