红景天多糖的保肝活性及其脂质体的制备研究

发布时间：2020-10-09 17:51

　　肝脏是人体内重要的代谢器官,它负责人体的新陈代谢和某些外源性化合物的解毒。但同时,在肝脏的代谢和解毒过程中产生的有毒有害物质可能会导致急性和慢性的肝损伤,如果损伤无法修复,肝功能会受到影响,造成严重的后果。目前,肝病已成为了影响人类健康的最常见的疾病之一,肝组织的坏死、炎症、纤维化、癌症等给患者带来了巨大的痛苦。近年来,植物多糖因其具有多种药理活性,且来源广泛、毒性较低,越来越受到科研工作者的重视。红景天作为一种作用广泛的传统中药,它的使用已有千年历史。多糖作为红景天的主要活性成分之一,对其研究的较少,因此本课题的研究主要是从传统药用植物红景天提取出天然活性产物多糖,对其结构特征进行分析,评价红景天多糖体内的保肝作用,并制备成多糖纳米脂质体促进保肝药效。第一章综述本章主要分为两部分,第一部分对多糖目前的提取分离纯化技术,结构解析方法进行了综述,着重介绍了近5年来多糖结构解析方法的研究进展。第二部分主要对红景天多糖的结构、生物活性和制剂应用三个方面的研究进展进行了综述。为本课题研究从红景天中分离纯化出单一多糖组分、并进行结构解析、活性测定以及制剂制备提供了理论支撑和研究方向。第二章红景天多糖的分离纯化及理化性质研究本章采用水提醇沉从红景天的根茎中得到红景天粗多糖。使用sevage法脱蛋白,脱去蛋白质81.07%,大孔树脂D315对其进行脱色,脱色效果较好。粗多糖进一步经纤维素DEAE-52柱和Sephadex G-100凝胶柱分离纯化,得到两种纯化多糖组分RRP1和RRP2。第一个是纤维素DEAE-52的水洗脱组分,命名为RRP1,第二个是纤维素0.1 M Nacl洗脱组分进一步过凝胶Sephadex G-100后水洗脱组分,命名为RRP2。对RRP1和RRP2进行了理化性质测定,结果表明RRP1含有89.31±1.18%多糖,4.97±0.54%蛋白质和0.90±0.21%糖醛酸。RRP2含有80.19±1.68%多糖,14.26±0.59%糖醛酸和2.12±0.37%蛋白质。两种多糖的紫外光谱显示含有微量的蛋白和核酸。使用HPLC-ELSD进行了分子量测定,HPLC图谱显示RRP1和RRP2均为单一对称峰,分子量分别为5.5 kDa和425.7 kDa。第三章红景天多糖RRP1和RRP2的结构特征研究本章对红景天多糖(RRP1和RRP2)的结构进行了研究,采用了化学分析法和仪器分析法相结合测定分析了红景天多糖的单糖组成、糖苷键位置、特征性官能团、糖苷键的类型以及表面形态等。主要包括:采用PMP柱前衍生化高效液相色谱法测定了RRP1和RRP2的单糖组成,结果表明,RRP1和RRP2均由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成,但摩尔比不同,分别为0.69:0.1:0.15:1:0.51:7.5和0.15:0.19:1.01:0.18:0.47:1。红外光谱显示RRP1和RRP2均存在吡喃糖环和糖醛酸。同时,RRP1是以α-型和β-型糖苷键连接,而RRP2只含有α-糖苷键。核磁共振分析则进一步验证了RRP1和RRP2由五种单糖组成以及它们的糖苷键类型。高碘酸氧化和Smith降解分析推测,RRP1中阿拉伯糖和葡萄糖主要以1→3连接,甘露糖,鼠李糖和半乳糖主要是由1→2,6、1→6、1→2或1→4连接。RRP2中,鼠李糖,葡萄糖和半乳糖主要以1→3连接,存在甘油和赤藓糖醇表明在RRP2中的甘露糖和阿拉伯糖主要是由1→2、1→6、或1→4连接。X射线衍射结果表明RRP1和RRP2都是半结晶物质,刚果红实验得到的信息是RRP1具有三螺旋构象,而RRP2不具有三螺旋构象。扫描电镜(SEM)观察显示,RRP1粉末的表面呈现出层状和不规则的树枝状结构,而RRP2具有褶皱的片状结构,边缘上有滴状凸起。原子粒显微镜(AFM)检测表明,RRP1为链状结构,宽度或长度范围是从1.2μm至2.5μm;其高度约为1-3.5 nm,说明有分子聚集。RRP2表现出不同尺寸(40-200 nm)的颗粒,这些颗粒的高度范围约在1-4.5 nm,同样有分子聚集在一起。第四章红景天多糖的体外抗氧化活性测定和体内保肝作用的研究本章首先测定了RRP1和RRP2的体外抗氧化活性。结果表明,与多糖RRP2相比,RRP1具有显著的体外抗氧化作用,其DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除率分别能达到90.54%、83.55%和72.50%,并与剂量正相关。成功建立了四氯化碳(CCl_4)诱导小鼠急性肝损伤模型,通过给药不同计量的RRP1和RRP2,评价了其保肝活性。实验结果表明,与模型组相比,多糖RRP1显著降低了血清中ALT和AST水平以及肝组织中MDA含量,增加了肝组织中CAT、SOD和GSH水平,并且RRP1的各剂量组均达到了显著性的效果。组织切片可以看到,CCl_4可引起小鼠肝细胞坏死、炎症细胞浸润等病理变化,而多糖RRP1能够减轻小鼠的肝细胞损伤、炎症细胞浸润面积减少。同时各项实验结果均表明RRP1各剂量组比相同剂量的RRP2显示出更好的肝保护作用。各项实验均指出,RRP1具有较好的抗氧化活性和对CCl_4诱导的小鼠急性肝损伤的肝保护作用。第五章红景天多糖RRP1脂质体的制备及其保肝药效评价本章采用逆相蒸发法制备了红景天多糖RRP1的脂质体(RRP1L),以包封率为指标,在单因素试验的基础上利用响应面分析(选用Box-Behnken模型)优化了制备处方,并考察了最优处方制备出的脂质体的包封率、平均粒径、形态和稳定性等指标。通过建立四氯化碳(CCl_4)诱导小鼠急性肝损伤的动物模型,以相同剂量的红景天多糖组分RRP1做对照,连续给药7天,考察了脂质体RRP1L的保肝效应。实验结果表明,红景天多糖RRP1脂质体制备的最优处方是,磷脂多糖比为29.17:1,磷脂胆固醇比为6.98:1,磷脂吐温80比为9.20:1,旋蒸温度为60℃,按照此处方制备的脂质体包封率为73.94±1.16%,与模型的预测值接近。质量评价结果显示,RRP1L的形状呈类球形,平均粒径测定为137.32±7.28nm,分散性系数测定(PDI)为0.198±0.006。Zeta电位测定为-28.50±0.98 mV,表明RRP1L大小均匀,稳定性良好。稳定性试验结果同样表明,脂质体RRP1L在15天常温条件下未出现明显的沉淀,包封率降低不显著,稳定性良好。药理实验结果表明,在连续给药7天后,与模型组相比,脂质体RRP1L给药组降低了血清中ALT和AST水平以及肝组织中MDA含量,增加了肝组织中CAT、SOD的活性和GSH的含量,RRP1L具有较好的保肝效果。在与相同剂量的多糖RRP1给药组比较下,各项指标的结果均表明,脂质体RRP1L给药组比直接给药多糖RRP1在保护肝脏效果方面表现的更好,具有应用价值。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R284;R285
【部分图文】：

流程图,分离纯化,流程,蒸馏水

图 2.1 红景天多糖分离纯化流程Figure 2.1 The isolation and purification process of Rhodiola rosea polysaccharides2.2.3 多糖组分 RRP1 和 RRP2 的理化性质测定2.2.3.1 RRP1 和 RRP2 的多糖含量测定采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，按照 Duboi 等报道的方法并做了一些小的修改[57]。标准曲线的绘制：将 D-葡萄糖（10mg）标准品用适量蒸馏水溶解，转移至100 mL 的容量瓶中并定容，配制成 0.1 mg/mL 的葡萄糖溶液。然后分别吸取 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于 10 mL 试管中，各试管加蒸馏水补至 0.5 mL，以0.5 mL 蒸馏水作为空白。然后再加入预先配制的苯酚水溶液（5%）0.8 mL，涡旋混合均匀，再加入浓硫酸 3.5 mL，涡旋混合均匀，室温条件下放 25 min，于490 nm 波长下测定吸光度。将浓度设定为 x 轴，将吸光度值设定为 y 轴，绘制

标准曲线图,葡萄糖,蒸馏水,考马斯亮蓝

图 2.2 葡萄糖标准曲线图Figure 2.2 Standard curve of glucoseRP1 和 RRP2 的蛋白含量测定考马斯亮蓝方法（Bradford 法）测定蛋白质含量[58]。的配制：将牛血清蛋白标准品（100mg）置于烧杯中，加适量蒸馏转到 1L 的容量瓶中，继续加蒸馏水定容，配置出浓度是 0.1mg/质溶液。精确称取考马斯亮蓝（G250）100mg，用适量蒸馏水溶解瓶中，倒入 50 ml 95%的乙醇与 100 mL 85%的磷酸，用蒸馏水定容曲线的绘制：分别吸取蛋白质标准溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，每管加入蒸馏水补到 1 mL，以蒸馏水做空白。然后分别在各管

标准曲线,牛血清蛋白,标准曲线图,糖醛酸含量

图 2.3 牛血清蛋白标准曲线图Figure 2.3 Standard curve of bovine serum albumin.3 RRP1 和 RRP2 的糖醛酸含量测定根据硫酸咔唑法测定糖醛酸含量[59]。溶液的配制：将葡萄糖醛酸（10 mg）置于烧杯中用适量蒸馏水溶解，00mL 的容量瓶中并定容，配制成 100μg/mL 的葡萄糖醛酸标准溶液。酸钠 1.195g 溶于 250mL 浓硫酸中。称取咔唑 75mg，加入无水乙醇 50为 0.15%。标准曲线的绘制：分别吸取半乳糖醛酸溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、于 10 mL 具塞玻璃试管中，每管加蒸馏水至 1 mL，然后分别加入 5 钠-硫酸溶液，涡旋混合均匀，于沸水中加热 10 min，拿出冷却至室温

【参考文献】