衰老(Aging)是生物个体随年龄增长而发生的不可逆的退行性变化。目前,人口老龄化已成为全球性的社会问题。为了延缓衰老,临床上常使用一些合成的抗氧化剂来清除体内自由基及代谢废物,但长期用药会对机体产生毒副作用。因此,探索和开发天然抗氧化剂对于延缓衰老具有重要意义。糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一种全球性的内分泌代谢疾病,常伴随着各种急慢性并发症的发生,致死率高。目前,糖尿病的主要治疗方法包括注射胰岛素和口服降血糖药物,但这些方法在长期使用中会产生毒副作用,因此,寻找高效、无毒的天然降血糖药物仍是医学界的重要研究课题。杏鲍菇[Pleurotus eryngii(DC.etFr.)Quel.]是我国广泛栽培的一种食药兼备的珍稀蕈菌,具有丰富的营养价值和广泛的生物活性。本课题以杏鲍菇(P.eryngii)为出发菌株,进行液体深层发酵获得菌丝体。通过水提醇沉法获得杏鲍菇菌丝体多糖(P.eryngii mycelia polysaccharides,PMPS),分离纯化后得到PMPS-1和PMPS-2,并对两种多糖的结构及其抗衰老、抗糖尿病的生理活性进行研究,研究结果如下:(1)杏鲍菇菌丝体多糖的提取及分离纯化:为保持多糖的生物活性,采用较为温和的水提醇沉法提取多糖,去蛋白处理后,PMPS得率为22.89±1.73mg/g。采用DEAE-52纤维素离子交换柱层析和Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析对PMPS进行分级纯化,得到纯化组分PMPS-1和PMPS-2,得率分别为463.42±25.09mg/g和287.65±16.71mg/g。(2)杏鲍菇菌丝体多糖的结构测定:(1)紫外扫描光谱(Ultraviolet spectrum)分析结果表明,PMPS-1和PMPS-2均不含蛋白质和核酸。(2)高效液相色谱(High pressure liquid chromatograph,HPLC)分析结果表明,杏鲍菇PMPS-1为不均一多糖,重均分子量(Weight-average molecularweight,Mw)为3.24×10~5Da;杏鲍菇PMPS-2为均一多糖,Mw为1.95×10~4Da。(3)气相色谱(Gas chromatograph,GC)分析结果显示,PMPS-1含有甘露糖和葡萄糖,其质量分数为12.13%和87.87%,摩尔比为1.00:7.24;PMPS-2含有木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖,其质量分数为3.21%、17.47%、14.66%和64.66%,摩尔比为1.00:4.54:3.81:16.79。(4)红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)分析结果显示,PMPS-1和PMPS-2均为β-型糖苷键连接的呋喃糖。(5)扫描电镜结果说明,PMPS-1分子量较大,可能具有长链结构或多分枝结构,分子之间作用力较小,易产生交叉粘连;PMPS-2分子量较小,分子间相互作用力相对较大,可能形成紧密的结构。(3)杏鲍菇菌丝体多糖抗氧化及抗衰老功效:(1)体外抗氧化试验表明,杏鲍菇PMPS-1和PMPS-2具有清除羟基自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的能力。PMPS-2的抗氧化能力强于PMPS-1,可能与PMPS-2具备较低的分子量、单糖组成中含有木糖和半乳糖等结构特征相关。(2)体内抗氧化试验证明,杏鲍菇PMPS-1和PMPS-2可以显著抑制小鼠体重和胸腺指数的异常降低,提高组织器官中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)和总抗氧化能力(Total antioxidant capability,T-AOC)活性,降低丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,提高皮肤组织含水率及羟脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)含量,表明PMPS-1和PMPS-2具有较强抵制氧化应激的活性。(3)对肝脏、大脑、皮肤和胸腺的组织病理学观察结果表明,PMPS-1和PMPS-2能够减少组织中坏死及凋亡细胞的数量,缓解氧化应激对组织器官的病理性损伤。(4)杏鲍菇菌丝体多糖降血糖及抗糖尿病功效:(1)体外试验表明,PMPS-1和PMPS-2对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制活性,且PMPS-2的抑制效果强于PMPS-1。(2)对小鼠空腹血糖的影响:PMPS-1和PMPS-2灌胃处理能够降低糖尿病小鼠血糖水平。(3)对小鼠氧化应激的影响:PMPS-1和PMPS-2均能显著抑制糖尿病小鼠肝脏、肾脏和胰脏组织中SOD、GSH-Px、过氧化氢酶(Catalase,CAT)和T-AOC活性的降低及脂质过氧化物(Lipid peroxide,LPO)和MDA水平的升高,对氧化应激引起的肝脏、肾脏和胰脏的损伤有较强的保护作用。(4)对小鼠脂代谢的影响:PMPS-1和PMPS-2能显著抑制糖尿病小鼠血清中甘油三酯(Triacylglycerols,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和极低密度脂蛋白胆固醇(Very low-density lipoprotein cholesterol,VLDL-C)水平的升高以及高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平的降低,表明杏鲍菇菌丝体多糖能够改善小鼠的脂代谢紊乱情况。(5)对小鼠血清中炎症因子的影响:PMPS-1和PMPS-2能显著抑制糖尿病小鼠血清中核转录因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)水平的升高,说明杏鲍菇菌丝体多糖能够减轻糖尿病小鼠机体的炎症反应。(6)杏鲍菇菌丝体多糖对糖尿病小鼠器官的修复作用:PMPS-1和PMPS-2可显著降低小鼠血清中的谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)和谷草转氨酶(Aspartate transaminase,AST)的活性,降低尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)和肌酐(Creatinine,CRE)的水平,提高白蛋白(Albumin,ALB)水平,抑制器官指数的升高,以及减轻小鼠肝脏、肾脏和胰脏的病理学损伤,说明杏鲍菇菌丝体多糖能够在高糖状态下保护肝脏、肾脏和胰脏免受损伤。上述结果表明,PMPS-1和PMPS-2具有体外和体内抗氧化活性,能够减轻氧化应激损伤,延缓衰老;同时能改善糖尿病小鼠的糖代谢和脂代谢,减轻氧化应激和炎症反应对机体的损伤,对糖尿病及其并发症有预防和治疗作用。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R284.2;R285
【部分图文】：
山东农业大学博士学位论文液分别置于 6 个 100mL 容量瓶中，加水定容，振荡摇匀，得葡萄糖稀释4）制作葡萄糖标准曲线：分别精密量取 6 种浓度的葡萄糖稀释液 2mL 于以 2mL 去离子水作空白对照，分别加入配好的 5.5%苯酚溶液 1mL，振入浓硫酸 5mL，立即摇匀，于 40℃水浴锅静置 30min，取出后冷水浴 5 波长处测定 OD 值，以吸光度 OD490nm为纵坐标，葡萄糖浓度（μg/mL）作标准曲线，得回归曲线（图 2-1）。回归方程 y=0.0139x-0.0107（R2=0.
菇菌丝体生物量后的杏鲍菇菌丝体为大小均匀的乳白色颗粒，有杏仁清香，经称重、菌丝体生物量为 4.62g/L。菇菌丝体多糖的分离纯化蛋白质并进行冷冻干燥处理后的杏鲍菇菌丝多糖（PMPS）为乳白色PMPS 的得率为 22.89±1.73mg/g。E-52 纤维素离子交换柱层析1 显示，杏鲍菇菌丝多糖（PMPS）经过 DEAE-52 纤维素离子交换柱分，分别命名为 PMPS-1 和 PMPS-2，分别由去离子水和 0.2mol/LNS-1 和 PMPS-2 的得率分别为 463.42±25.09mg/g 和 287.65±16.71mg/
图 3-2 PMPS-1 的 Sephadex G-100 葡聚糖凝胶柱洗脱曲线Fig. 3-2 Elution curves of PMPS-1 on Sephadex G-100 column图 3-3 PMPS-2 的 Sephadex G-100 葡聚糖凝胶柱洗脱曲线
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本文编号：
2835294
