菱角壳化学成分及体外生物活性研究

发布时间：2020-10-10 20:37

【摘要】：本文采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)技术对菱角壳提取物的乙酸乙酯部分进行了研究,建立了11批次不同来源菱角壳的UPLC指纹图谱,研究了菱角壳体外抗肿瘤细胞增殖活性和抗氧化活性,并结合指纹图谱进行谱效关系研究。具体内容如下:首先,对菱角壳的提取方法进行了研究,建立并优化了UPLC指纹图谱分析方法。获得较佳的提取条件为:提取溶剂为乙醇/水(V/V,60/40),提取温度40°C,提取时间30 min,提取方式为超声提取,然后过滤旋干得粗提物,粗提物复溶于水,并依次用石油醚和乙酸乙酯萃取,优选乙酸乙酯层为目标层。通过优化色谱分析参数,获得了较佳的UPLC分析条件:色谱柱:Waters Acquity UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8μm);流速:0.2 mL/min;进样量:1.0μL;柱温:30°C;PDA检测器的检测波长:280 nm;采用梯度洗脱。该方法具有良好的精密度、稳定性和重现性。其次,采用UPLC-QTOF-MS技术对菱角壳提取物的乙酸乙酯部分进行了初步的成分鉴定,共检测到39种化合物,有35种化合物被初步鉴定或标识。其中,菱角壳主要成分为单宁类,包括13种没食子单宁类和15种鞣花单宁类成分,并对其裂解机理进行了研究。最后,对11批次不同来源菱角壳提取物的乙酸乙酯部分的UPLC指纹图谱和体外生物活性进行了谱效研究。菱角壳UPLC指纹图谱共匹配得到30个共有峰。通过相似度评价方法,得到11批次的菱角壳的相似度较高;通过聚类分析方法,可将菱角壳分为两大类;通过主成分分析方法,得到30个共有峰中的3个主要成分对菱角壳分类的贡献率最大,分别是化合物10(三-O-没食子酰-D-葡萄糖)、20(三-O-没食子酰-鞣花酰-D-葡萄糖)和22(1,2,3,6-四-O-没食子酰-β-D-葡萄糖)。在11批次菱角壳提取物的HepG2细胞抗增殖活性研究中发现,在3.13-100.00μg/mL菱角壳给药浓度范围内,当菱角壳中没食子酸单宁类总含量越高时,其IC_(50)值越高,即对HepG2细胞的抗增殖活性越弱;当菱角壳中鞣花单宁类总含量越高时,其IC_(50)值越低,即对HepG2细胞的抗增殖活性越强。结合化学结构分析,鞣花酰基基团(HHDP)是决定菱角壳抗增殖能力强弱的决定性基团。在11批次菱角壳提取物的DPPH自由基清除能力的抗氧化实验中研究发现,当菱角壳的总成分含量越高时,其抗氧化能力越强。结合菱角壳中化合物的结构特征分析推测,菱角壳的抗氧化能力与化合物中的羟基个数有关,一般羟基个数越多,抗氧化能力越强。通过研究菱角壳指纹图谱与两种体外活性间的谱效关系,可以为菱角壳的质量评价提供方法依据。
【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284;R285
【图文】：

菱角壳化学成分及体外生物活性研究宁存在的形式不仅仅是以一个葡萄糖单元为中心，多个葡萄糖单元为中心的则更为广泛。王克建等人[57]运用 HPLC-ESI/MSn方法对核桃仁中的化学成分做了初步鉴定，核桃仁中含有丰富的酚酸类成分，主要以含 HHDP 基团的鞣花单宁为主，共鉴定得到 4 种鞣花酰基葡萄糖异构体和 2 种二鞣花酰基葡萄糖类异构体。除上述常规的鞣花单宁的结构外，还有一类鞣花单宁的结构表现为葡萄糖C4→C6 位的氧化偶联，如 Smeriglio 等[58]在其研究中发现，化合物 Eugeniin 继续进行 C2→C3 位氧化偶联时，可形成木麻黄素结构（Casuarictin）。

图 1-2 缩合单宁的结构特征[60]Figure 1-2. The characteristics of condensed tannins1.2.2 单宁类化合物的药理作用药理学研究表明，单宁具有抗肿瘤细胞增殖[62]、抗氧化[63]、抗病毒[64]、抗菌[65]和抗炎[63]等作用。（1）抗肿瘤细胞增殖作用李长伟等人[62]从南酸枣树皮中分离出没食子酸、没食子酸乙酯和 5 种没食子单宁类成分（1-O-没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖、1,4-二-O-没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖、1,6-二-O-没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖、1,4,6-三-O-没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖和 1,3,4,6-四-O-没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖），分别将其作用于人慢性髓细胞性白血病 K562 细胞，用 MTT 法来评估其抗增殖活性，除 1-O-没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖和 1,3,4,6-四-O-没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖抗增殖活性较弱以外，其余化合物均对 K562 细胞表现出较强的抗肿瘤细胞增殖活性。柯里拉京（corilagin）是一种典型的没食子单宁，其结构由一个 HHDP 基团

分分析需要运用到液质联用技术，而三氟乙酸和磷酸在质谱中会有较大残留，故这两者不作考虑。相同浓度的 0.1%甲酸和 0.1%乙酸相比较的情况下，0.1%甲酸的分离效果会更好，而乙酸浓度则要在 1%左右才能达到与 0.1%甲酸相类似的分离效果，因此，经过综合考虑，最终确定 ACN-0.1%甲酸为流动相体系。（3）柱温、流速的选择柱温和流速是影响色谱分离的另一重要因素，但同时也影响着系统的耐受压力。在流速 0.2 mL/min 下，试验了 30-50 °C 不同柱温的影响；在柱温 30 °C 下，考察了 0.2-0.3 mL/min 不同流速的影响。结果表明升高柱温和加快流速反而会导致色谱峰共洗脱，出峰变快。考虑到系统压力等因素，确定本实验柱温为 30 °C，流速为 0.2 mL/min。（4）检测波长的选择采用 Waters ACQUITY UPLC 的 PDA 检测器，在波长范围 190-400 nm 下扫描菱角壳提取物供试品溶液的色谱图。结果发现，与波长在 254 nm 下的谱图相比，波长在 280 nm 下检测到的峰较多（图 2-1），峰的响应值较佳，且基线噪音影响小，因此确定 280 nm 为本实验较佳的吸收波长。
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本文编号：2835558