千层纸素A下调LDH-A阻断HSC有氧糖酵解依赖性收缩抗肝纤维化的机制研究

发布时间：2020-10-11 00:31

　　 [背景]肝纤维化是对如病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝等各种慢性肝损伤的一种补偿性修复过程。肝脏损伤时,静息的肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)转分化为具有增殖、收缩特性的肌成纤维细胞,随后分泌大量的细胞外基质,在肝实质中积聚并促进肝纤维化的发生发展。肝星状细胞增强的收缩性增加了肝窦血流的阻力从而加重了肝窦毛细血管化和重塑,以及促进瘢痕组织挛缩介导肝脏对损伤的反应。细胞收缩是一个非常耗能的过程,新进证据表明HSC活化时,有氧糖酵解是一种更快和更短的能量产生途径,可用于满足其快速增殖的高要求。因而,揭示HSC收缩与糖酵解之间的联系进而靶向抑制HSC活化收缩成为防治肝纤维化的新策略。越来越多的基础和临床研究揭示传统中医药在治疗肝纤维化方面具有确切的疗效。本课题组前期研究结果表明千层纸素A(oroxylinA)作为黄零的重要活性成分之一,其在抗肝纤维化方面具有确切的疗效。前期研究发现,千层纸素A可防止肝纤维化中LSEC的血管生成进而防治肝纤维化;千层纸素A也可抑制与HSC自噬诱导相关的肝纤维化。但我们认为,千层纸素A的抗纤维化作用的潜在机制尚不完全清楚。本研究旨在明确千层纸素A对肝纤维化的防治效应,研究千层纸素A对HSC收缩的调节并阐明潜在的机制。本研究的结果为开发千层纸素A作为抗肝纤维化药物提供实验依据,为千层纸素A的作用及机理研究提供全新的思路和明确的方向。[方法]1.体外研究选取HSC-LX2细胞株作为本论文体外研究对象。胶原晶格收缩和骨架染色表现HSC收缩;Western Blot和免疫荧光用于检测磷酸化MLC2蛋白水平;葡萄糖摄取、葡萄糖消耗、乳酸生成、细胞外酸化率试剂盒检测糖酵解通量及产物水平;Real-Time PCR和Western Blot用于检测糖酵解限速酶:己糖激酶2、磷酸果糖激酶1和M2型丙酮酸激酶的基因及蛋白水平;ELISA用于检测糖酵解限速酶活性;过表达质粒和siRNA转染用于正反验证靶点LDH-A效应。2.体内研究将30只ICR雄性小鼠随机分为5组(每组6只):正常对照组、CCl4模型组、CC14+千层纸素A处理组、CC14+千层纸素A处理加腺病毒空载体、CC14+千层纸素A处理加腺病毒包装LDH-A过表达质粒。肝组织的HE、Masson、天狼星红染色表现肝组织结构与胶原沉积现象;α-SMA免疫组化染色表现肝组织中HSC活化;扫描电镜观察肝窦毛细管化;试剂盒检测血清中丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、间接胆红素水平;ELISA实验用于检测血清中透明质酸、层粘连蛋白和III型前胶原的表达;Real-time PCR检测肝组织中目的基因表达、Western blot及免疫荧光双染检测肝组织中目的蛋白水平。随机选取自南京中医药大学附属医院南京市第二医院临床肝纤维化及正常肝脏样本5例。以Real-time PCR考察肝纤维化患者和正常患者肝脏中LDH-A的基因表达。[结果]千层纸素A抑制HSC骨架形成及MLC2磷酸化进而抑制HSC收缩,千层纸素A能降低HSC中有氧糖酵解能力,并且抑制有氧糖酵解限速酶己糖激酶2、磷酸果糖激酶1和M2型丙酮酸激酶的基因、蛋白表达和酶活性。糖酵解抑制剂2-DG的加入证实千层纸素A是通过阻断HSC有氧糖酵解进而抑制HSC收缩。进一步的探索发现千层纸素A对于LDH-A(有氧糖酵解关键靶标)有显著的调控作用,我们发现LDH-A在肝纤维化患者的肝脏中较正常患者肝脏中具有高水平的基因表达,而千层纸素A可以下调HSC中LDH-A的基因、蛋白表达及其酶活性。接下来LDH-A药理性抑制剂、LDH-A siRNA、LDH-A过表达质粒的加入正反验证千层纸素A通过下调LDH-A发挥其阻断HSC糖酵解和抑制HSC收缩的作用。最后,体内腺病毒包装LDH-A过表达质粒验证千层纸素A通过对LDH-A的调控发挥其抗肝纤维化作用,千层纸素A可降低肝纤维化时升高的血清学的肝损伤及肝纤维化指标;千层纸素A缓解肝纤维化时肝脏结构的紊乱和胶原的沉积;千层纸素A也抑制了肝纤维化造成的HSC活化以及修复肝纤维化时消失的窗孔。但千层纸素A对肝纤维化的干预作用均被LDH-A过表达所阻断。此外,千层纸素A可阻断纤维化时升高的HSC收缩行为和HSC有氧糖酵解水平,这一效应也被LDH-A过表达抵消。体内外结果表明下调LDH-A进而抑制HSC有氧糖酵解依赖性收缩是千层纸素A抗肝纤维化作用的基础。[结论]本研究将有氧糖酵解途径与HSC的收缩表型联系起来,并发现千层纸素A通过下调LDH-A阻断了HSC有氧糖酵解依赖性收缩并减少了肝纤维化。本研究将LDH-A作为阻断HSC有氧糖酵解和治疗肝纤维化的有希望的靶标,也为千层纸素A调控LDH-A发挥抗纤维化的开发提供了一定的实验依据。
【学位单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

图１－１?ＨＳＣ活化??Ｆｉｇ?１－１?Ｓｔｅｌｌａｔｅ?ｃｅｌｌ?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．?（Ｄｏｎ?Ｃ．?Ｒｏｃｋｅｙ，?Ｍ．Ｄ．?Ｃｌｉｎ?Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ?Ｈｅｙａｔｏｌ．??

胞（Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＭＦｓ）的细胞的主要来源［４］。在纤维化肝脏中，静息的ＨＳＣｓ??活化并转分化为具有增殖、收缩特性的肌成纤维细胞，随后合成并分泌大量的??ＥＣＭ并在肝实质中过度沉积从而促进肝纤维化进程（图１）?ＨＳＣｓ作为肝特??异性周细胞获得收缩表型的认识是了解这些细胞生物学的重要里程碑［６］。ＨＳＣｓ??增强的收缩性一方面增加了肝窦血流的阻力从而加重了肝窦毛细血管化和重塑，??另一方面通过加剧慢性肝损伤过程中细胞外基质的重塑介导肝脏对损伤的反应??［７］。因此，阐明如何调节ＨＳＣｓ收缩可能促进慢性肝病的治疗策略的发展。??＾?Ｃｏｒａｎ？ｌＮｌｔｙ?；??１／?＿?Ｉ??Ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ?ｓｉｅｌｌａｔａ?Ａｃｌ？ｖ？ｔｅｄ?ＢｔｅＨａｔｅ?／?：?Ｐ０ＧＦ?Ｒｂｒｏｇｃｎｅ？ｉ＊??ｃｅｌｌ?（ｎｏｒｍａｌ）?ｃｅｌｌ?（Ｉｎｊｉｔｆｅｄ）?／?：?＾??■■Ｊ；?－ｒ－?＼??＇良—一乂?斗－一：：ｉ??＼?Ｉ?＼?＾?＾?｜??｜?Ｍ?｜?＃顯—??丨—。ｎ?！??＂Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ??Ａｕｔｏｐｈａｇｙ??Ｃｅｌｌ?ｆａｔｅ??图１－１?ＨＳＣ活化??Ｆｉｇ?１－１?Ｓｔｅｌｌａｔｅ?ｃｅｌｌ?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．?（Ｄｏｎ?Ｃ．?Ｒｏｃｋｅｙ，?Ｍ．Ｄ．?Ｃｌｉｎ?Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ?Ｈｅｙａｔｏｌ．??１??

Ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ?ＨＳＣ?Ａｃｔｉｖａｔｅｄ?ＨＳＣ??图１－２?ＨＳＣ有氧糖酵解在ＨＳＣ活化中的作用??Ｆｉｇ?１－２?Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｈｅｐａｔｉｃ?ｓｔｅｌｌａｔｅ?ｃｅｌｌｓ?（ＨＳＣｓ）?ｔｈｒｏｕｇｈ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ａｅｒｏｂｉｃ??ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ?（Ｗａｒｂｕｒｇ?ｅｆｆｅｃｔ）．?（Ｈｏｕ?Ｗ．?Ｓｖｎ?ＷＫ．?Ｆｒｏｎｔ?Ｃｅｌｌ?Ｄｅｖ?Ｂｉｏｌ．?２０１８．?１２：６：１５０．）??１．３肝星状细胞有氣糖酵解可能的靶标一ＬＤＨ－Ａ??葡萄糖通过有氧糖酵解被代谢为丙酮酸，其可以在三羧酸（ＴＣＡ）循环中被??氧化代谢为Ｃ０２，并通过氧化磷酸化过程产生大量的ＡＴＰ，丙酮酸还可以还原代??谢成有机酸或醇［２Ｇ】。乳酸脱氢酶Ａ?（ＬａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅＡ，ＬＤＨ－Ａ）是葡萄糖??消耗以及将丙酮酸转化为乳酸的所必需的，Ｗａｒｂｕｒｇ效应中的关键因子＾１。ＬＤＨ－??Ａ通过诱导丙酮酸转化为乳酸，同时将还原型烟酰胺腺嘌呤二核甘酸??（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＮＡＤＨ）氧化为?ＮＡＤ－丨２２】。其中，糖酵解的中??间产物被肿瘤细胞利用合成蛋白质、核酸及脂类等，从而为肿瘤细胞等高增殖性??细胞本身的生长提供了必需的物质基础Ｐ＾４１。许多高增殖性细胞都高水平表达??ＬＤＨ－Ａ
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本文编号：2835771