异甘草酸镁对P-gp及CYP3A影响及其作用机制的初步研究

发布时间：2020-10-11 04:27

　　 异甘草酸镁为第四代甘草酸衍生物,现今广泛用于临床治疗慢性病毒性肝炎和化疗药物所致肝病。作为保肝药,异甘草酸镁已呈现好的应用前景,而其产生的药物相互作用仍需探究。因此,本实验从药物的外排和代谢这两条最基础的途径入手,研究异甘草酸镁在体内外对P-gp和CYP3A影响及其产生影响的调控通路,旨在为其临床合用药物提供科学依据。目的:本课题先通过大鼠急性肝损伤实验,确定异甘草酸镁对急性肝损伤大鼠体内P-gp和CYP3A1表达的影响,接着以人肝癌细胞株HepG2细胞为对象研究异甘草酸镁对HepG2细胞内P-gp和CYP3A4活性及表达的影响。最后以HepG2细胞为研究对象研究异甘草酸镁对核受体PXR mRNA水平和蛋白表达水平的影响,初步探讨异甘草酸镁对P-gp和CYP3A4的作用是否通过PXR调控。方法:在体内实验中,使用CCl_4造模急性肝损伤模型,建模成功后随机分为三组:正常组,CCl_4急性肝损伤造模模型组,造模给药异甘草酸镁组。对各组进行体内给药后,取出相应的样本进行后续实验,全自动生化仪检测血清学指标,HE染色检测各组大鼠肝组织病理状态。RT-PCR和Western blot法对各组大鼠肝组织中P-gp及CYP3A1的m RNA和蛋白表达量进行测定。体外实验中,MTT实验确定异甘草酸镁的细胞给药浓度,然后采用Rho-123实验检测异甘草酸镁对HepG2细胞功能的影响,以及采用细胞色素CYP3A4酶活测定试剂盒测定异甘草酸镁对HepG2细胞中CYP3A4酶活性的影响。最后研究异甘草酸镁对P-gp及CYP3A4影响的分子机制,RT-PCR和Western blot法检测了P-gp、CYP3A4及核受体PXR mRNA及蛋白表达的影响实验,分析考察CYP3A4,P-gp的表达与PXR表达水平的关联性。结果:(1)各种大鼠血清学指标ALT、AST及HE染色实验确定了CCl_4造模的成功及异甘草酸镁对急性肝损伤模型的缓解作用。(2)RT-PCR和Western blot技术检测异甘草酸镁对CCl_4造模急性肝损伤大鼠中P-gp及CYP3A1酶基因和蛋白表达的影响,结果显示,CCl_4造模组的P-gp基因和蛋白与正常组相比是上调的,给药异甘草酸镁后抑制了P-gp的基因和蛋白的表达。而CYP3A1酶的基因变化趋势与之相反,给药后诱导了CYP3A1酶的基因和蛋白的表达。(3)采用MTT法进行细胞的毒性实验,结果发现0-480μM的对HepG2细胞的生长抑制率≤20%,为HepG2细胞无毒浓度。经过前期的预实验以及文献参考,故选取异甘草酸镁的给药浓度梯度为7.5μM,15μM,30μM。(4)Rho-123实验检测异甘草酸镁对HepG2细胞中P-gp功能的影响,蓄积和外排实验结果都表明了7.5μM,15μM,30μM的异甘草酸镁均能抑制P-gp的功能。且随着浓度增加,其抑制作用越强。(5)通过对HepG2细胞中CYP450亚酶CYP3A4酶活的检测,结果揭示了7.5μM的异甘草酸镁能抑制HepG2细胞中CYP3A4酶活性,而15μM,30μM的异甘草酸镁则能显著性的诱导CYP3A4酶的活性。(6)RT-PCR和Western blot实验检测高中低浓度的异甘草酸镁对HepG2细胞中CYP3A、P-gp及其上游调控因子PXR基因和蛋白表达的影响,结果显示7.5μM,15μM的异甘草酸镁对CYP3A表达有抑制作用,30μM则表现出显著的诱导作用,而30μM的异甘草酸镁却抑制了P-gp基因和蛋白的表达,对于其上游调控因子PXR的基因和蛋白表达的测定实验中显示15μM,30μM的异甘草酸镁均能上调PXR的表达。结论:异甘草酸镁可上调急性肝损伤大鼠及HepG2细胞中CYP3A基因的转录和翻译水平,且异甘草酸镁诱导了HepG2细胞中CYP3A4酶的活性,从而促进了经CYP3A4酶介导的药物的代谢。另外高浓度的异甘草酸镁对P-gp功能和表达均有显著抑制作用,提示当临床合用异甘草酸镁与P-gp底物时,可以提高该药物的生物利用度。此外,对于其上游调控因子核受体PXR而言,中高浓度的异甘草酸镁均能诱导其表达。本实验的研究结果可能为异甘草酸镁与其他药物联用提供一定的理论基础。
【学位单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

4脏组织病理伊红 HE 染色可以发现，正常组肝脏形态正大而圆，核膜清晰，核仁明显，无细胞变性型组中，肝细胞变性坏死，肝细胞肿胀较 CCl4造模成功；造模给药异甘草酸镁组仍少，肝小叶结构排列略整齐（图 1C），可up ALT (IU/L) AST (IU/L) Albmal 54.14 ± 15.24 147.36 ± 20.15 34.38l43686.50 ±658.34**5978.67 ±736.13**31.31+ CCl4787.50 ±127.99**#1868.33 ±267.54**#30.43

一部分 异甘草酸镁对急性肝损伤大鼠体内肝组织中 P-gp 及 CYP3A1 酶表达的影草酸镁对急性肝损伤大鼠体内P-gp和CYP3A1酶CR 结果表明，与空白组比较 CCl4造模组显著诱导了 MDR1）,给药 20 mg/kg MgIg 显著下调了造模所诱导的 MDR1mR）。而在急性肝损伤大鼠体内 CYP3A1 mRNA 却与之相反现造模急性肝损伤后可显著抑制 CYP3A1mRNA 的表达（P显著诱导其表达。

甘草酸镁对急性肝损伤大鼠体内 MDR1 和 CYP3A1 酶蛋白表达的影响，与正常组相比：*与造模组相比：##P<0.01. The effects of MgIg on the protein expression of MDR1 and CYP3A1 in acute rats, **P<0.01 vs group;##P<0.01 compared with Model group论肝脏对药物代谢和处置中有着十分重要的作用，大多数药物和毒物经生物转化作用而排出体外[48]。急性肝损伤已经成为临床上发生的常草酸镁注射液作为新一代的甘草酸制剂目前已用于临床[49]，作为急性尤其是化疗药物导致的急性肝损伤患者应用最多的一种保肝制剂，其护肝细胞膜及改善肝功能等作用，并且据文献研究发现异甘草酸镁产物单 18α异构体甘草次酸，具有更强的保肝抗炎及抗氧化等多种功肝细胞膜，减轻肝细胞炎症和坏死，促进肝细胞的再生和修复[50~51]。
【参考文献】

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本文编号：2836066