类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜炎和软骨破坏为主要病理特征的系统性的自身免疫疾病。RA发病机制尚不明确,但已有大量的研究表明,巨噬细胞参与了RA的发生和发展。RA患者滑膜中大量浸润的巨噬细胞,被视为是RA的早期标志,且与疾病活动度相关。根据表型和功能,巨噬细胞主要分为M1型促炎型巨噬细胞和M2型抗炎型巨噬细胞。正常生理状态下,巨噬细胞的表型处于动态平衡。但是在RA患者以及关节炎动物模型中,多种因素会打破这种平衡,引起M1/M2型巨噬细胞数量和比例的失衡,导致M1型巨噬细胞不断增多,从而加剧炎症反应。然而,目前临床上并没有特定针对巨噬细胞的药物。文献报道,前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)能够通过c AMP-CREB/CRTC通路,激活Krüppel样因子4(Krüppel-like factor4,KLF4)转录因子,促进M2型巨噬细胞极化。课题组前期研究发现,PGE2水平在佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis,AA)大鼠血清中升高,在AA滑膜细胞中,PGE2不断刺激下,G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2)转膜增加,EP4受体过度脱敏,环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)水平降低。GRK2是G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)的负性调节剂,可特异性地活化GPCRs,使其磷酸化,从而介导受体脱敏,但PGE2介导的巨噬细胞上的EP受体过度脱敏,尤其是EP4受体的过度脱敏尚未见报道。RA患者以及关节炎动物模型中,M1/M2型巨噬细胞的比例失衡是否与巨噬细胞中EP受体的过度脱敏有关,也尚未见报道。芍药苷-6-氧-苯磺酸酯(CP-25),是我们所研发的一种具有抗炎免疫调节作用的新型活性化合物,能够改善AA大鼠/胶原诱导性关节炎(collagen-inducedarthritis,CIA)小鼠模型临床表现,调节巨噬细胞细胞因子平衡。前期研究发现,CP-25能够通过抑制AA大鼠滑膜细胞中的GRK2转膜,恢复EP4的膜表达,升高c AMP水平,从而抑制AA大鼠滑膜细胞的异常增殖。但CP-25对巨噬细胞M1/M2比例的失衡是否具有作用,作用机制如何,尚不清楚。目的:观察PGE2及其信号对CIA小鼠巨噬细胞和Raw264.7细胞极化的影响及CP-25对巨噬细胞极化的作用和作用机制,为揭示PGE2及其信号转导参与RA中巨噬细胞M1/M2比例失衡以及GRK2作为CP-25的作用靶点调控巨噬细胞极化提供实验依据。方法:用鸡Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂制备CIA小鼠炎症模型,原代培养CIA小鼠腹腔巨噬细胞(Peritoneal macrophage,PM)和骨髓源巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMM);用Western blot法检测巨噬细胞中i NOS,Arg1,p-CREB,CREB水平以及EP4和GRK2的膜表达;QRT-PCR法检测巨噬细胞IRF4,IRF5,Mincle,YM-1,IL-10,TNF-α和EP m RNA各亚型的表达;流式细胞术检测巨噬细胞表型CD86,CD206和F4/80的表达,巨噬细胞表面EP4和GRK2的表达以及巨噬细胞吞噬作用;ELISA法检测PGE2和c AMP的水平;CP-25(35 mg/kg)灌胃给药,依那西普(4.5mg/kg)腹腔注射,进行多发性关节炎指数评分;激光共聚焦显微观察法检测EP4和GRK2在巨噬细胞上的分布;免疫共沉淀法检测巨噬细胞上EP4和GRK2的相互作用;高内涵成像仪观察巨噬细胞中EP4和GRK2的表达;si RNA瞬时沉默Raw264.7中GRK2基因表达;CRISPR/Cas 9敲除Raw264.7中GRK2基因表达;用CRISPR/Cas 9技术构建GRK2 KO小鼠,取GRK2 KO小鼠PM和BMM;结果:1.CIA小鼠巨噬细胞中M1/M2的比例变化选取CIA小鼠PM,结果显示,与正常组对比,模型组中巨噬细胞M1标记i NOS水平上升,M2标记Arg1水平降低;CD86/CD206的比例升高;巨噬细胞吞噬作用增强。IRF5,Mincle和TNF-α的m RNA水平升高,RF4,YM1和IL-10的m RNA水平降低。我们还检测了CIA小鼠BMM中i NOS和Arg1的水平,结果显示,与正常组对比,模型组中巨噬细胞i NOS水平上升,Arg1水平降低。2.PGE2及其信号对CIA小鼠巨噬细胞极化的影响为了探究PGE2-EP-c AMP-CREB在巨噬细胞极化中的作用,我们检测了PGE2及其信号的表达。与正常组对比,模型组中血清和PM上清中PGE2水平升高,EP4受体膜表达降低,GRK2膜表达升高,c AMP和p-CREB水平降低。c AMP类似物dbc AMP能够降低正常组和模型组小鼠PM中M1/M2的比例,PGE2(1μM)能够降低正常组小鼠PM的M1/M2比例,对模型组小鼠PM极化无显著性作用。提示PGE2对正常组和模型组小鼠PM极化作用的不同,可能与PGE2的浓度、EP受体敏感性和细胞极化状态等有关。那么PGE2的四个EP受体是哪个发挥作用的呢?结果显示,EP2和EP4受体的总表达升高,EP4受体的m RNA水平升高。提示EP2和EP4受体可能参与小鼠CIA的发病进程。为进一步明确PGE2是通过哪个受体调控c AMP-CREB,我们用EP2受体激动剂和EP4受体激动剂同样条件下刺激正常组和模型组PM,EP4受体激动剂与PGE2(1μM)有相似的结果,提示PGE2可能通过EP4受体调控c AMP-CREB。PGE2刺激下正常组小鼠PM中EP4受体膜表达升高,GRK2膜表达升高,模型组小鼠PM中EP4受体膜表达无显著性变化,GRK2膜表达升高。提示EP4的过度脱敏,GRK2转膜增加,可能与PGE2对模型组小鼠PM极化作用失调有关。利用激光共聚焦,发现PM中的EP4受体和GRK2主要分布在胞膜和胞质中,Merge图提示PM中的EP4受体和GRK2存在相互作用;我们进一步通过免疫共沉淀法,发现在正常组中,GRK2和EP4受体间存在相互作用,模型组中GRK2和EP4受体的相互作用增强。3.PGE2及其信号对Raw264.7细胞极化的影响体外刺激诱导M1和M2型巨噬细胞。与M0组对比,M1组中EP4受体膜表达降低,GRK2膜表达升高,c AMP和p-CREB水平降低。M2组中EP4受体膜表达升高,GRK2膜表达降低,c AMP和p-CREB水平升高。c AMP类似物dbc AMP能够降低M0,M1和M2型巨噬细胞中M1/M2的比例。PGE2刺激M0组中,PGE2(100n M,1μM)组CD86/CD206降低,EP4膜表达升高,c AMP水平升高;PGE2刺激M1组中,PGE2(1μM,10μM)组CD86/CD206升高,EP4膜表达降低,c AMP水平降低;PGE2刺激M2组中,PGE2(10n M,100n M,1μM,10μM)组CD86/CD206降低,EP4膜表达升高,c AMP水平升高。激光共聚焦显微镜观察M0,M1和M2型巨噬细胞,发现EP4和GRK2主要分布在胞浆和胞膜,Merge图提示EP4和GRK2存在一定的相互作用;免疫共沉淀法显示,与M0组对比,M1组中GRK2-EP4的相互作用增强,M2组中GRK2-EP4的相互作用无显著性变化。4.GRK2对巨噬细胞极化的影响及对EP4过度脱敏的作用为进一步探讨GRK2对巨噬细胞上EP4受体过度脱敏的影响及GRK2对巨噬细胞极化的影响,用si RNA沉默GRK2基因表达后,发现GRK2 si RNA干扰后的Raw264.7细胞M1/M2比例降低。用CRIPR/Cas9敲除GRK2基因后,发现Raw264.7-GRK2-/-细胞中CD86/CD206比例降低。用PGE2(10μM)不同时间点刺激Raw264.7细胞,结果显示,Raw264.7中CD86/CD206逐渐降低,20 min达到最低值,1h后与对照组相比差异无统计学意义。用PGE2(10μM)不同时间点刺激GRK2 si RNA沉默的Raw264.7细胞,GRK2 si RNA沉默的Raw264.7细胞中CD86/CD206逐渐降低,30 min达到最低值,2h后与对照组相比差异无统计学意义。PGE2(10μM)刺激下,Raw264.7-GRK2-/-细胞中CD86/CD206逐渐降低,2h达到最低值,12h时无显著性差异。随着PGE2(10μM)刺激时间的延长,EP4受体的膜表达逐渐升高,2h处达到最高值,之后下降,12h的EP4受体膜表达与对照组无显著性差异。5.CP-25通过抑制GRK2膜转位恢复PGE2-EP4-c AMP-CREB正常信号转导调控巨噬细胞极化治疗小鼠CIACP-25(35mg/kg)可明显降低CIA小鼠的多发性关节炎指数评分,表明CP-25对CIA小鼠具有治疗作用。CP-25(35mg/kg)可不同程度降低血清和PM上清中PGE2的水平,降低CIA小鼠PM和BMM中i NOS水平,升高Arg1水平;使CD86/CD206的比例升高;巨噬细胞吞噬作用减弱。IRF5,Mincle和TNF-α的m RNA水平降低,RF4,YM1和IL-10的m RNA水平升高。CP-25(35mg/kg)能够升高EP4受体的膜表达,降低GRK2的膜表达,减弱EP4-GRK2间的相互作用。结论:1.CIA小鼠巨噬细胞中M1/M2比例升高,CP-25(35mg/kg)能够降低M1/M2的比例,恢复M1和M2的平衡。2.CIA小鼠血清和PM上清中PGE2水平升高,PGE2不断刺激下,PM中EP4受体过度脱敏,c AMP水平和p-CREB表达减少。PGE2-EP4-c AMP-CREB信号通路介导了CIA小鼠巨噬细胞向M1型极化。3.CIA小鼠巨噬细胞的GRK2异常升高,与EP4受体共表达,GRK2介导EP4受体过度脱敏参与CIA小鼠巨噬细胞PGE2-EP4-c AMP-CREB信号异常导致M1型巨噬细胞极化。4.CP-25抑制GRK2膜转位,恢复EP4受体的敏感性,增加c AMP水平和p-CREB表达,从而促进M2型巨噬细胞极化,调控巨噬细胞M1/M2的比例平衡。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
图 1 Lenti-Cas9-puro 病毒载体Figure 1 Lenti-Cas9-puro virus vector，计数稀释至细胞悬液浓度为 1×的细胞悬液，每孔细胞初始数为 过程中细胞是否生长正常）sG A 组G P 组缓慢融化。用无血清培养基将慢
GV391病毒载体
3.22.4 sgRNA 表达载体构建测序峰图Adrbk1-sgRNA(05986-1)-baaac TCGGAGGTTCTGACAAATCT cAdrbk1-sgRNA(05987-1)-aCACCg AGTCAAAGATCTCTCGGCTGAdrbk1-sgRNA(05987-1)-baaac CAGCCGAGAGATCTTTGACT c
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 李仲娟;杨朝令;胡芳;喻昕;汪宏良;;灵芝酸G对小鼠巨噬细胞免疫活性的研究[J];国际检验医学杂志;2013年13期
2 曾焱华;吴移谋;游晓星;詹利生;粟盛梅;;穿透支原体脂质相关膜蛋白对小鼠巨噬细胞核因子κB活性的影响[J];南华大学学报(医学版);2009年04期
3 周静;赵小霞;马吉春;方芳;宋献美;柳忠辉;台桂香;;强力天麻杜仲胶囊对小鼠巨噬细胞活性的调节作用[J];安徽农业科学;2008年33期
4 吴玉刚,张玉敏,韩梅;复方溶囊散对模型小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响[J];内蒙古民族大学学报(自然科学版);2001年04期
5 赵长鹰,沈英森,唐颖;金水六君煎口服液对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响[J];暨南大学学报(自然科学与医学版);1999年06期
6 查国章;陈一舫;李沛涛;杨军祥;罗国杨;黄伯若;;8—8 恒定旋转低频脉冲磁场对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响[J];医学物理;1987年Z1期
7 陈祖楷;曹巧莉;;8—9 静磁场对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响[J];医学物理;1987年Z1期
8 张莹;张德山;王桂山;;扶正中药复方对小鼠巨噬细胞吞噬功能影响的实验研究[J];中医药学报;1987年04期
9 刘玉生 ,欧振岸 ,窦丹 ,韩强涛,李文简;气功外气对小鼠巨噬细胞Fc受体及吞噬功能的影响[J];第一军医大学学报;1988年04期
10 查国章,陈一舫,杨军祥,罗国扬,黄伯若;磁场对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响[J];湖南医学院学报;1988年01期
相关博士学位论文 前10条
1 杨雪枝;G蛋白偶联受体激酶2介导PGE2-EP4-cAMP-CREB信号转导异常参与CIA小鼠巨噬细胞极化及CP-25的作用[D];安徽医科大学;2019年
2 蒋跃绒;赤芍801调节血管炎症反应和血小板活化的基础与临床研究[D];中国中医研究院;2005年
3 张鹏宇;激活素调控小鼠巨噬细胞活性的信号传导机制研究[D];吉林大学;2006年
4 郭长明;鱼源无乳链球菌感染小鼠巨噬细胞差异转录基因的筛选及功能研究[D];南京农业大学;2014年
5 李冠霖;炭疽致死毒素对小鼠巨噬细胞杀伤机制的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
6 刘倩宏;深度测序技术对羊布鲁菌16M株感染小鼠巨噬细胞转录组学的研究[D];吉林大学;2012年
7 冯雪莹;小鼠巨噬细胞吞噬凋亡细胞的炎症调节及性别差异[D];北京协和医学院;2011年
8 谭兵;RNA干扰在体外、体内抑制TNF-α表达的实验研究[D];广州医学院;2008年
9 许雷鸣;Annexin-1对小鼠巨噬细胞的功能影响及机制研究[D];华中科技大学;2009年
10 王韵;热休克反应对小鼠巨噬细胞IL-18基因表达调节的研究[D];第三军医大学;2003年
相关硕士学位论文 前10条
1 赵萍萍;p62及其互作蛋白Vps34在LPS诱导的小鼠巨噬细胞自噬中的作用[D];内蒙古大学;2019年
2 钟伟娟;沉默RIG-I基因对NDV活化小鼠巨噬细胞TRAIL、TNF-α和IL-6基因表达及NO产生的影响[D];广西医科大学;2019年
3 徐绮嫔;硒对DHA调控LPS诱导小鼠巨噬细胞细胞因子表达与脂质代谢的影响研究[D];四川农业大学;2017年
4 刘荣娇;田鼠型鼠疫菌在人和小鼠巨噬细胞内抗吞噬溶酶体的差异性研究[D];南华大学;2018年
5 李格格;C5a受体拮抗剂PMX205在小鼠巨噬细胞中的抗炎作用[D];吉林大学;2018年
6 章平贵;TYRO3和AXL对巨噬细胞内TLR4信号通路的影响及其作用机制[D];南昌大学;2018年
7 阿木古楞;TLR2、TLR4、NLRP3及PGE_2在小鼠巨噬细胞防御金葡菌侵入胞内中的作用[D];内蒙古农业大学;2017年
8 肖玲;乌司他丁下调LPS诱导的小鼠巨噬细胞MiR-21表达及初步调控机制研究[D];重庆医科大学;2017年
9 李杨;苹果多糖对RAW264.7小鼠巨噬细胞的免疫调节作用[D];甘肃农业大学;2017年
10 娄远蕾;镧抑制脂多糖诱导小鼠巨噬细胞产生一氧化氮的机制[D];南昌大学;2007年
本文编号：
2836454
