苦碟子对脑缺血再灌注损伤火毒证大鼠缺血半暗带Notch信号通路的影响

发布时间：2020-10-12 04:05

　　 背景急性缺血性卒中因其高的发病率和致残率,给家庭和社会带来沉重的负担,已成为我国重要的公共卫生问题。有效的治疗对于减轻或改善卒中所致的神经功能缺损症状,减轻卒中所致的疾病负担至关重要。中医治疗卒中有着悠久的历史,在长期的医学实践中,历代医家总结了丰富的临床经验,尤其是王永炎院士提出的“毒损脑络”学说,将中医对中风的认识推向了一个新高度,也推进了中医治疗中风的进程。根据“毒损脑络”学说,提出了清热解毒通络法。苦碟子注射液在缺血性卒中治疗方面疗效确切,可以减轻炎症反应并改善神经功能和临床结局,但其作用机制尚未明确。近年的研究显示,Notch信号通路可能参与了脑梗死炎症反应过程。因此本研究拟探讨苦碟子注射液干预急性脑梗死损伤的机制及与Notch信号通路的相关性。目的观察苦碟子注射液对脑缺血再灌注损伤火毒证大鼠缺血半暗带炎症反应、Notch信号通路、神经元病理结构的改变及神经元凋亡情况的影响,探讨苦碟子治疗急性脑梗死火毒证的疗效机制。方法将128只SPF级SD雄性大鼠,按照随机数字表法随机分为4组:假手术组、模型组、Notch-1抑制组(DAPT组)及苦碟子组,每组32只。除假手术组外,其余各组采用Longa联合角叉菜胶腹腔注射制作大鼠左侧大脑中动脉阻塞再灌注火毒证模型。再灌注后立即腹腔注射,其中假手术组及模型组给予等体积的生理盐水(3.6ml/kg·d),各给药组分别给予对应药物腹腔注射,其中苦碟子组给予苦碟子注射液3.6ml/kg·d,DAPT组给予DAPT 500ug/kg·d,每天1次,连续给药3d。于造模后第3h、24h、48h、72h取材,采集缺血半暗带脑组织,采用Western blot及RT-PCR法检测苦碟子注射液治疗后Notch-1、Jagged-1、Hes-1、IKK、NF-κ B、Caspase-3在缺血半暗带脑组织中的表达;用透射电镜观察苦碟子注射液干预后缺血半暗带神经元超微结构的改变;HE染色观察神经元一般形态结构改变情况;TUNEL染色观察缺血半暗带神经元凋亡情况。结果1.大鼠神经功能缺损评分:组间比较:假手术组神经功能评分为0分。再灌注3h、24h、48h DAPT组和苦碟子组神经功能评分与模型组相比无显著下降(p0.05),再灌注72h时DAPT组和苦碟子组评分较模型组下降显著(p0.05);DAPT组与苦碟子组神经功能评分组间比较无统计学差异(p0.05)。组内比较:模型组各时间点神经功能评分比较无统计学差异(p0.05);DAPT组、模型组神经功能于24h后呈逐渐下降趋势,其中72h神经功能评分较3h显著下降(p0.05)。2.与假手术组相比,模型组3h即可见Notch-1、Jagged-1、Hes-1、IKK、NF-κ B、caspase-3mRNA和蛋白表达增加(p0.05);且相同时间模型组上述基因和蛋白表达均高于假手术组(p0.05)。模型组Notch-1、IKK、caspase-3蛋白的表达于3h～24h达高峰,随后呈下降趋势;NF-κ B蛋白的表达与24h～48h达高峰;Jagged-1、Hes-1蛋白于3h～48h持续高表达。3.与模型组相比,DAPT治疗减少缺血半暗带Notch-1、Jagged-1、Hes-1、IKK、NF-κB、caspase-3 mRNA和蛋白的水平,部分存在统计学差异;组内比较,DAPT组Notch信号通路蛋白表达趋势与模型组大致相似。4.与模型组相比,苦碟子注射液可减少缺血半暗带Notch-1、Jagged-1、Hes-1、IKK、NF-κ B、caspase-3 mRNA和蛋白的表达,部分存在统计学差异。苦碟子组缺血半暗带Notch-1、Jagged-1、Hes-1、IKK、NF-κ B、Caspase-3mRNA和蛋白的表达水平低于DAPT组,部分存在统计学差异。组内比较,苦碟子组Notch-1、IKK蛋白的表达于3h～24h达高峰,随后呈下降趋势(p0.05);Jagged-1、caspase-3表达于24h达高峰;Hes-1、NF-κ B蛋白的表达于24h～48h达高峰。5.透射电镜观察:与假手术组相比,模型组神经元结构出现不同程度损伤,可见核固缩、异染色质增多,线粒体破坏明显,电子致密;随着缺血时间的延长,模型组神经元结构改变明显。同一再灌注时间相比,DAPT组、苦碟子组神经元细胞器结构较模型组改善。苦碟子组改善情况略微好于DAPT组。6.HE染色:模型组大鼠观察到梗死侧脑组织破坏,结构疏松,神经元数量减少,多呈三角形,可见胞浆浓缩、胞核固缩。与模型组相比,苦碟子组神经元结构明显改善;DAPT组神经元结构较模型组改善。7.TUNEL染色结果:模型组TUNEL阳性细胞数明显多于假手术组。再灌注48h时,DAPT组、苦碟子组凋亡神经元数量显著少于模型组(p0.05),DAPT组与苦碟子组之间差异不显著(p0.05)。结论1.急性脑梗死后Notch信号通路被激活,缺血脑组织中Notch-1、Jagged-1、Hes-1、IKK、NF-κ B和caspase-3的表达明显增多。2.苦碟子注射液可通过抑制炎症反应,减少神经元凋亡减轻脑缺血再灌注损伤,改善火毒证大鼠神经功能。苦碟子的治疗效果优于DAPT。3.苦碟子注射液减轻脑缺血再灌注损伤可能与调控Notch信号通路有关。4.苦碟子在给药后3h时即可抑制Notch信号通路活性,且相同时间点Notch信号通路活性低于模型组。因此,临床上宜尽早予以苦碟子注射液治疗急性脑梗死,以改善神经功能。
【学位单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

取正常大鼠脑组织观察神经元超微结构。正常组神经元结构正常，细胞核大而圆，??染色均匀，表面光滑；胞质中含大量游离核糖体，粗面内质网和线粒体结构正常；血管??壁结构完整，血管内皮细胞、基底膜连接紧密。见图３－１。??ＢＲ??Ａ：正常组１２０００Ｘ：?Ｂ：正常组７００００Ｘ??图３－１正常组神经元电镜结果??３．?２假手术组??假手术各时间组神经元细胞器形态未见明显改变，偶见自噬体。见图３－２。??＿画??Ａ：假手术组７００００Ｘ；?Ｂ：假手术组７００００Ｘ??图３－２假手术组神经元电镜结采??３．３模型组??模型组Ｉｄ组较３ｈ组细胞器结构改变明显，细胞质明显水肿，线粒体嵴模糊，部分??嵴和膜融合，可见膜结构不同程度破坏，电子致密，吋见核固缩，０噬体多见。模型组??随着缺血时间的延长，细胞器结构改变明显，可见核固缩、胞浆浓缩，胞核异染色质增??多，固缩神经元较多；线粒体肿胀，线粒体嵴枚糊，部分嵴和膜融含，线粒体电子致密??度增高，可见线粒体－自噬体形成，粗面内质Ｍ肿胀、脱颗粒：血管内皮细胞水肿，内??皮细胞间紧密连接断裂。阽图３－３。??５１??

取正常大鼠脑组织观察神经元超微结构。正常组神经元结构正常，细胞核大而圆，??染色均匀，表面光滑；胞质中含大量游离核糖体，粗面内质网和线粒体结构正常；血管??壁结构完整，血管内皮细胞、基底膜连接紧密。见图３－１。??ＢＲ??Ａ：正常组１２０００Ｘ：?Ｂ：正常组７００００Ｘ??图３－１正常组神经元电镜结果??３．?２假手术组??假手术各时间组神经元细胞器形态未见明显改变，偶见自噬体。见图３－２。??＿画??Ａ：假手术组７００００Ｘ；?Ｂ：假手术组７００００Ｘ??图３－２假手术组神经元电镜结采??３．３模型组??模型组Ｉｄ组较３ｈ组细胞器结构改变明显，细胞质明显水肿，线粒体嵴模糊，部分??嵴和膜融合，可见膜结构不同程度破坏，电子致密，吋见核固缩，０噬体多见。模型组??随着缺血时间的延长，细胞器结构改变明显，可见核固缩、胞浆浓缩，胞核异染色质增??多，固缩神经元较多；线粒体肿胀，线粒体嵴枚糊，部分嵴和膜融含，线粒体电子致密??度增高，可见线粒体－自噬体形成，粗面内质Ｍ肿胀、脱颗粒：血管内皮细胞水肿，内??皮细胞间紧密连接断裂。阽图３－３。??５１??

Ａ：模型组?３ｈ?１２００００Ｘ；?Ｂ：模型组?２４ｈ?１５００００Ｘ；?Ｃ：模型组?４８ｈ?７００００Ｘ；??Ｄ：模?７２ｈ?１００００Ｘ??图３－３模型组神经元电镜结果??３．４?ＤＡＰＴ?组??ＤＡＰＴ组各时间组与模型组相比，神经元形态稍好，细胞核染色比较均匀，异染色质??较少，部分线粒体肿胀、嵴模糊，部分粗面内质网肿胀、脱颗粒，线粒体、粗面内质网??结构改变较模型组轻。见图３－４。??瞧??＿＿??Ａ：?ＤＡＰＴ?组?３ｈ?１２００００Ｘ；?Ｂ：?ＤＡＰＴ?组?２４ｈ?５００００Ｘ；?Ｃ：?ＤＡＰＴ?组?４８ｈ?７００００Ｘ??Ｄ：?ＤＡＰＴ?组?７２ｈ?１２００００Ｘ??图３－４?ＤＡＰＴ组神经元电镜结果??５２??
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本文编号：2837613