华蟾毒精诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的机制研究
发布时间：2020-10-13 00:49
目的:本实验旨在观察华蟾毒精(Cinobufagin,CBF)对人乳腺癌MCF-7细胞株的生长影响,并研究探讨其可能的分子作用机制。方法:常规体外培养人乳腺癌MCF-7细胞株,取指数生长期的细胞传代24 h后分别加入不同浓度(0.1,0.2,0.4,0.8和1.6μM)的CBF进行处理,分别继续培养24,48,72 h后,用CCK-8法检测细胞增殖活性,紫杉醇(0.02,0.04,0.08,0.16和0.32μM)作为阳性药物对照组,同时设置阴性对照组(空白组);不同浓度(0,0.2,0.4和0.8μM)的CBF作用于MCF-7细胞48 h后,Hoechst 33258染色下,通过荧光显微镜观察MCF-7细胞的形态并分析凋亡情况;不同浓度(0,0.2,0.4和0.8μM)的CBF作用于MCF-7细胞48 h后,Annexin V-APC/7-AAD双染法下,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,PI单染下,流式细胞仪分析细胞周期;不同浓度(0,0.2,0.4和0.8μM)的CBF作用于MCF-7细胞48 h后,实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)检测Bax和Bcl-2基因表达变化情况,Western-blot试验检测Bax和Bcl-2蛋白表达变化情况。结果:CCK-8试验结果表明CBF可以抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖,并呈浓度和时间依赖性(P0.05),其24,48,和72 h的IC_(50)(半抑制浓度)分别为0.94,0.44和0.22μM,紫杉醇对照组MCF-7细胞24,48,和72h的IC_(50)分别为0.20,0.08和0.02μM;Hoechst 33258染色后荧光显微镜下观察,可见空白对照组为均匀弥散的蓝色荧光,而药物组细胞呈现明显不均一的亮蓝色荧光,提示CBF作用组MCF-7细胞发生了凋亡;Annexin V-APC/7-AAD双染法后,流式细胞仪所测0.2,0.4和0.8μM药物组凋亡细胞百分比分别为22.94%、50.68%和68.29%,而空白对照组凋亡细胞百分比为5.87%,结果表明CBF明显诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡,并呈浓度依赖性(P0.05);PI单染后,流式细胞仪分析0.2,0.4和0.8μM药物组G1细胞百分比分别为49.11%,57.54%和63.75%,而空白对照组为39.45%,提示CBF作用后的MCF-7细胞呈现G1期阻滞;实时荧光定量PCR法和Western-blot试验显示CBF作用于MCF-7细胞48h后Bax基因和蛋白表达上升,Bcl-2基因和蛋白表达下降,并呈浓度依赖性,且Bax/Bcl-2比例逐渐升高(P0.05)。结论:CBF能抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖并使细胞呈现G1期阻滞,具有时间和浓度依赖性;CBF能促进人乳腺癌MCF-7细胞凋亡,并呈浓度依赖性,其作用机制可能与上调Bax表达和下调Bcl-2表达有关。CBF可能是一种潜在的以Bcl-2家族为作用靶点的抗肿瘤活性物质。
【学位单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285
【部分图文】：
规体外培养人乳腺癌 MCF-7 细胞株，取指数生长期细胞传代 240，0.1，0.2，0.4，0.8 和 1.6 μM）CBF 分别作用 24，48 和 72 h。用 CCK-8 法检测细胞活性，记录结果并绘制细胞生长曲线，软件F-7 细胞的 IC50在 24，48 和 72h 分别为 0.94，0.44 和 0.22 μM。照组，每组设三个复孔，在不同浓度（0，0.02，0.04，0.08,，0.16 和分别作用于 MCF-7 细胞 24，48 和 72 h 后， IC50分别为 0.20， 结果如图 2 所示，随着 CBF 作用浓度的增加，细胞的存活率下降（用时间的延长，细胞的存活率亦下降（图 2，a），表明 CBF 对 M抑制作用呈时间和浓度依赖性（P < 0.05）；作为阳性对照，随着增加，细胞的存活率下降（图 2，d）；随着作用时间的延长，细（图 2，c），表明紫杉醇对 MCF-7 细胞的生长抑制作用呈时间 < 0.05）。
CBF 作用 MCF-7 细胞 48 h 后，Hoechst 33258 染色下荧光显微仪的 MCF-7 细胞凋亡检测结果0，0.2，0.4 和 0.8 μM）CBF 作用于 MCF-7 48 h 双染下，流式细胞仪分析不同浓度组细胞凋亡情况（图相比，药物组细胞凋亡明显增多；0.2 μM 药物组、0.4 的细胞凋亡百分比分别为 22.94%、50.68%和 68.29%，而比仅为 5.87%；随着 CBF 药物浓度的增加，凋亡 MCF-有浓度依赖性（P < 0.05）。
26. （a）不同浓度 CBF 作用于 MCF-7 细胞 48 h 后，诱导细胞凋亡。左下象限：正常活细象限：早期凋亡细胞，右上象限：晚期凋亡细胞，左上象限：死亡细胞。（b）随着浓度的增加，凋亡细胞百分比逐渐上升，并呈浓度依赖性，*p< 0.05 vs. 空白对照组
【参考文献】
本文编号：2838514
【学位单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285
【部分图文】：
规体外培养人乳腺癌 MCF-7 细胞株，取指数生长期细胞传代 240，0.1，0.2，0.4，0.8 和 1.6 μM）CBF 分别作用 24，48 和 72 h。用 CCK-8 法检测细胞活性，记录结果并绘制细胞生长曲线，软件F-7 细胞的 IC50在 24，48 和 72h 分别为 0.94，0.44 和 0.22 μM。照组，每组设三个复孔，在不同浓度（0，0.02，0.04，0.08,，0.16 和分别作用于 MCF-7 细胞 24，48 和 72 h 后， IC50分别为 0.20， 结果如图 2 所示，随着 CBF 作用浓度的增加，细胞的存活率下降（用时间的延长，细胞的存活率亦下降（图 2，a），表明 CBF 对 M抑制作用呈时间和浓度依赖性（P < 0.05）；作为阳性对照，随着增加，细胞的存活率下降（图 2，d）；随着作用时间的延长，细（图 2，c），表明紫杉醇对 MCF-7 细胞的生长抑制作用呈时间 < 0.05）。
CBF 作用 MCF-7 细胞 48 h 后，Hoechst 33258 染色下荧光显微仪的 MCF-7 细胞凋亡检测结果0，0.2，0.4 和 0.8 μM）CBF 作用于 MCF-7 48 h 双染下，流式细胞仪分析不同浓度组细胞凋亡情况（图相比，药物组细胞凋亡明显增多；0.2 μM 药物组、0.4 的细胞凋亡百分比分别为 22.94%、50.68%和 68.29%，而比仅为 5.87%；随着 CBF 药物浓度的增加，凋亡 MCF-有浓度依赖性（P < 0.05）。
26. （a）不同浓度 CBF 作用于 MCF-7 细胞 48 h 后，诱导细胞凋亡。左下象限：正常活细象限：早期凋亡细胞，右上象限：晚期凋亡细胞，左上象限：死亡细胞。（b）随着浓度的增加，凋亡细胞百分比逐渐上升，并呈浓度依赖性，*p< 0.05 vs. 空白对照组
【参考文献】
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本文编号：2838514
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