大豆皂甙对Toll样受体4炎症信号通路分子表达的调控

发布时间：2020-10-13 23:13

　　 研究背景慢性非传染性疾病(Non-communicable chronic diseases,NCDs)严重危害人民健康,其预防和控制刻不容缓。研究表明,食物中的植物化学物可通过发挥抗炎活性而达到防制NCDs的作用。大豆皂甙(Soyasaponin,SS)是广泛存在于大豆及其制品中的一类植物化学物。近年来的研究表明SS具有抗炎活性,但其分子机理尚未彻底阐明。我们和其他实验室的前期研究结果发现,SS的抗炎活性可能与Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)有关,但SS调控TLR4信号通路的分子机理尚不清楚。目的本研究运用脂多糖(Lipopolysacchrides,LPS)和棕榈酸(Palmaticacid,PA)诱导建立巨噬细胞炎症模型,研究三种不同化学结构的大豆皂甙(A1、A2和I)对TLR4炎症信号通路中信号分子表达的影响,旨在探讨SS对TLR4信号通路的调控作用,阐明其抗炎活性的分子机理,为合理利用SS防制慢性炎症介导的NCDs提供新的思路和科学依据。方法1.实验分组(1)LPS和PA刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞.:分别采用浓度为1μg/mL LPS和 200 μmol/L PA 处理细胞不同时长(0 min、10 min、30 min、1h、3 h、6 h、12 h和24 h)。(2)SS干预LPS或PA刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞:不同浓度(10、20、40μmol/L)的SS(A1、A2、I)预孵育细胞2h,再根据上述实验的结果,分别选择合适的LPS或PA刺激细胞的处理时长,同时设置阴性对照组、1 μg/mLLPS阳性对照组或200 μmol/L PA阳性对照组。2.Western Blotting检测蛋白表达量收集细胞制备蛋白样品,运用Western Blotting方法检测TLR4信号通路中信号分子(TLR4、MD-2、CD14、TIRAP、MyD88、TRAM、TRIF、IRAK4、IRAK1和TRAF6)的蛋白表达。使用Image J分析获得目标条带的灰度值,实验至少重复三次,数据用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析,结果以Mean±SEM表示,P0.05表示统计差异显著。结果1.巨噬细胞LPS-TLR4炎症信号通路相关分子的蛋白表达LPS处理1 h和3 h可增加MyD88的蛋白表达(P0.05);LPS刺激3 h可增加IRAK4磷酸化水平(P0.05);LPS刺激3 h、6 h和12 h能增加IRAK1磷酸化水平(P0.05);LPS刺激30 min、1 h、3 h和6 h能上调信号分子TRAF6的蛋白表达(P0.05),而LPS刺激12 h和24 h则下调了 TRAF6的蛋白表达(P0.05),随着LPS刺激时间的增加,TRAF6蛋白表达呈先增加后降低的趋势。2.SS(A1、A2、I)对LPS-TLR4炎症信号通路相关分子蛋白表达的调控LPS刺激1 h后,浓度为40 μmol/L的SS-A2和10 μmol/L SS-I能抑制由LPS引起的MyD88表达上调(P0.05);LPS处理时间为3h时,不同浓度(10、20、40μmol/L)的 SS(A1、A2、I)能抑制 IRAK4 和 IRAK1 磷酸化水平(P0.05);LPS处理时间为12h时,不同浓度(10、20、40μmol/L)的SS-A1和不同浓度(10、20 μmol/L)的SS-A2能拮抗由LPS引起的TRAF6蛋白表达下降(P0.05)。3.巨噬细胞PA-TLR4炎症信号通路相关分子的蛋白表达PA刺激10min、30min、1h和3h可增加MyD88的蛋白表达(P0.05);与对照组相比,PA刺激10 min后,IRAK4磷酸化水平升高(P0.05),随着刺激时间的延长(30min、1h、3h、6h、12 h和24h),IRAK4磷酸化水平持续升高(P0.05);PA刺激时间为30 min、1 h和3 h时,IRAK1磷酸化水平升高(P0.05);PA刺激10min,TRAF6蛋白表达增加(P0.05),而PA刺激12 h时,TRAF6的蛋白量表达下降(P0.05)。4.SS(A1、A2、I)对PA-TLR4炎症信号通路相关分子蛋白表达的调控不同浓度(10、20、40 μmol/L)的 SS(A1、A2、I)能抑制由 PA 刺激 30min后引起的MyD88蛋白表达增加(P0.05);不同浓度(20、40μmol/L)的SS-A1和不同浓度(10、20、40μmol/L)的SS(A2和I)能抑制由PA刺激30min引起的IRAK4磷酸化水平增加(P0.05);PA处理时间为30min时,不同浓度(10、20、40μmol/L)的 SS(A1、A2、I)均能抑制 IRAK1 磷酸化水平(P0.05);PA刺激10 min时,浓度为10 μmol/L和40 μmol/L的SS-I能抑制由PA引起的TRAF6蛋白表达上调(P0.05),PA刺激12h,不同浓度(10、20、40μmol/L)的SS(A1、A2)能拮抗PA引起的TRAF6蛋白表达降低。结论1.LPS和PA刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞都能增加TLR4炎症信号通路中MyD88的表达以及促进IRAK4和IRAK1的磷酸化,但其表达变化的时间不同。2.LPS和PA刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞,短时间内能上调TRAF6的表达,长时间则会抑制TRAF6的表达,呈现先升高后降低的趋势。3.在LPS刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞中,SS-A2和SS-I能抑制MyD88蛋白表达;SS-A1、SS-A2和SS-I能抑制IRAK4和IRAK1的磷酸化;SS-A1和SS-A2可拮抗LPS长时间刺激而引起的TRAF6降低。4.在PA刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞中,SS-A1、SS-A2和SS-I能抑制MyD88的蛋白表达以及IRAK4和IRAK1的磷酸化;SS-A1和SS-A2可拮抗PA长时间刺激而引起的TRAF6蛋白表达量降低,SS-I可抑制PA短时间刺激而引起的TRAF6蛋白表达量升高。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285
【部分图文】：

年代分离和鉴定了五种不同结构的大豆皂甙［４６，?４７］，现根据大豆皂醇（也叫大豆??皂甙元）及其连接的糖侧链不同将其分为Ａ组、Ｂ组、Ｅ组和ＤＤＭＰ大豆皂甙??［４８］（如图１－１和表１－１所示）。其中，Ａ组大豆皂甙是一类以大豆皂甙元Ａ（ＳＧ－Ａ）??为配基，其Ｃ－２１位上连接羟基基团，Ｃ－３和Ｃ－２２位上各连接一个糖基的双糖链??皂甙。根据Ｃ－２２位上的终端糖单元是否含有乙酰基，分为脱乙酰化大豆皂甙（Ａ！、??Ａ２、Ａ３、Ａ＊、Ａ５、八６）和乙酰化大豆阜试（Ａａ、Ａｂ、Ａｃ、Ａｄ、Ａｅ、Ａｆ、Ａｇ、??Ａｈ）。Ｂ组大豆皂甙是一种单糖，配基为大豆皂甙元Ｂ?（ＳＧ－Ｂ），结构中Ｃ－２１位??连接的是一个氢原子，且仅在其Ｃ－３位上连接糖侧链。它们被分类为大豆皂甙Ｉ、??ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ，而有科学家根据糖侧链的不同将其命名为Ｂａ、Ｂｂ、Ｂｅ、Ｂｂ’、??４??

ＴＲＡＦ６分子［６５］。激活后的ＴＲＡＦ６分别通过ＮＦ－ｋＢ诱导激酶（ＮＩＫ）和ＭＡＰＫｓ??激酶（ＭＫＫ）激活ＮＦ－ｋＢ和ＭＡＰＫｓ信号通路［５９＇?６７］。另一方面通过ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ??途径激活ＮＦ－ｋＢ信号通路［６９］。如图１－２所示。??「免一冗?＾固４?＿??————??１／??ＴＲＩＦ?［ＴＲＡＦ６?＾?ＮＦ－ｋＢ??１?ＴＲＡＭ?Ｉ?＼??ｔｌｒ４?＼、??ｉ＿ｓ?丨匪?ｈ＿Ｍｓ］???ｃｎｓｔｏｒｙ????二＇??／??——？「ＩＲＦ５］?？?｜?ＩＲＦ５?：??图１－２?Ｔｏｌｌ样受体４信号通路示意图［７（）］??Ｆｉｇ．?１－２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＴＬＲ４?ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ?ｐａｔｈｗａｙ??ＴＬＲ４信号通路介导的慢性低度炎症对肥胖、ＩＩ型糖尿病等ＮＣＤｓ的发生和??发展起关键作用［７１］，本课题组前期研究以及其他课题组的相关报道均提示着大??９??

ｌｉｍｏｌ／Ｌ）的ＳＳ?（Ａｈ?Ａ２、Ｉ）预孵育后再经ＬＰＳ刺激的细胞中ＣＤ１４、ＭＤ－２和??ＴＬＲ４的蛋白表达水平也没有显著差异（ｉ＞＞０．０５），表明ＳＳ不影响炎性巨噬细胞??中ＣＤ１４、ＭＤ－２和ＴＬＲ４的蛋白表达（图３－４）。??３０??
【参考文献】

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本文编号：2839830