金丝桃素抗1型单纯疱疹病毒的作用及机制研究
发布时间：2020-10-14 02:19
背景与目的1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV-1)是以人类为唯一宿主的DNA双链病毒。人群感染非常普遍,容易引起潜伏感染。该病毒主要引起皮肤粘膜感染,免疫力低下者可导致多器官损害甚至肿瘤。目前,临床上使用的抗HSV药物为核苷类似物,如阿昔洛韦、更昔洛韦。由于耐药现象以及毒副作用的限制,开发研究新的抗病毒药物尤为重要。中草药是发掘新药的一个巨大宝藏。本研究拟从中草药单体中筛选抗单纯疱疹病毒有效的药物候选分子。筛选抗病毒药物有两条基本策略:一是以完整病毒为靶标筛选抗病毒复制的药物;二是以病毒的重要结构或功能性分子为靶标,筛选抗病毒复制的药物。前期我们以HSV-1完整病毒颗粒为靶标,在细胞水平进行大量的药物筛选后发现盐酸小檗碱和金丝桃素有较好的抗HSV-1复制的潜能,且金丝桃素具有更优的抗病毒作用。在此基础之上,本研究拟进一步探索金丝桃素抗病毒复制的作用机制。首先,通过对金丝桃素干扰HSV-1病毒的吸附、穿膜及基因转录的研究,探寻其抗HSV-1病毒的作用阶段。其次,通过生物信息学分析预测金丝桃素与HSV-1病毒复制关键蛋白碱性核酸酶(AN)可能发生相互作用,进而真核表达获得具有活性的重组AN蛋白,并对金丝桃素能否抑制其活性进行验证,以期较深入的解析金丝桃素抗HSV-1病毒的作用机制。同时,证实以AN分子为靶标可建立抗HSV-1病毒的“分子筛选模型”,为大规模从中草药单体中筛选有效抗病毒的候选药物奠定基础。方法1.金丝桃素抗HSV-1的药效学研究:不同浓度的金丝桃素(20、15、10、52.5和1.25μmol/L)溶液处理Vero细胞,通过MTT法检测其对Vero细胞的毒性作用;Reed-Muench法[1]计算HSV-1的病毒滴度;用HSV-1感染Vero细胞,通过细胞病变效应法(cytopathic effect,CPE)和空斑减数法(plaque reduction assay,PRA)检测金丝桃素抗HSV-1病毒的药物效应。2.金丝桃素抗HSV-1作用的机制研究:金丝桃素作用于HSV-1感染的吸附及穿入阶段,探讨其对HSV-1吸附及穿入宿主细胞的影响;RT-q PCR和Westernblotting考察金丝桃素的作用机理。3.HSV-1病毒AN的表达及金丝桃素对AN活性的抑制作用:通过生物信息学分析预测金丝桃素与AN的相互作用及其互作位点;巴斯德毕赤酵母表达系统表达AN,Ni-NTA亲和层析进行纯化,检测纯化后AN的核酸外切酶活性;最后,检测金丝桃素对AN活性的抑制作用。结果1.金丝桃素抗HSV-1的药效学研究:金丝桃素的半数中毒浓度(TC50)是17.02μmol/L,药物对病毒的半数有效浓度(IC50)是2.6μmol/L,选择性指数(selectivity index,SI)是6.55;HSV-1的病毒滴度为10-5.7;CPE法和PRA法检测金丝桃素有明显抑制HSV-1复制的作用。2.金丝桃素抗HSV-1作用的机制研究:金丝桃素可抑制HSV-1对宿主细胞的吸附及穿入;RT-q PCR结果表明金丝桃素可明显抑制HSV-1 ICP27 m RNA、ICP8m RNA、g D m RNA、UL12和UL53基因的表达;Western blotting结果显示金丝桃素可抑制病毒蛋白ICP4、ICP8和g D的表达。3.HSV-1碱性核酸酶AN的表达及金丝桃素对其活性抑制作用的研究:生物信息学预测金丝桃素与AN蛋白酶活性中心可发生相互作用,金丝桃素对AN的活性有潜在的抑制作用;通过毕赤酵母表达系统成功表达目的蛋白AN,亲和层析大量表达的AN获得了纯度较高的重组AN蛋白;酶活性检测AN具有明显的核酸外切酶活性,而金丝桃素可明显抑制其活性。结论1.金丝桃素有明显抑制HSV-1复制的作用。2.金丝桃素通过抑制病毒感染的多个阶段发挥抗病毒作用。3.通过生物信息学预测分析金丝桃素与AN蛋白酶活性中心可发生相互作用;巴斯德毕赤酵母表达系统成功表达了目的蛋白AN,纯度约85%;酶活性检测具有明显的核酸外切酶活性;金丝桃素明显抑制AN的活性作用。
【学位单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285
【部分图文】：
第一部分 金丝桃素抗 HSV-1 作用的药效学实验研究第一部分 金丝桃素抗 HSV-1 作用的药效学实验研究材料与仪器药物桃素购于上海源叶生物科技公司，纯度：98%，批号：PAO0408R素用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配成 30mmol/L 母液浓度，用 除菌后存于 4℃避光，使用前用 DMEM 培养基稀释至所需浓度。液相层析鉴定（图 1-1）。注射用阿昔洛韦（ACV），购于湖北潜：1411201。将 ACV 同上的方法配成 30mmol/L 母液浓度，过滤使用前用 DMEM 培养基稀释至所需浓度。实验中所用药物的 DM。
图 1-2 金丝桃素对 Vero 细胞的毒性Fig.1-2 Toxicity of hypericin to Vero cells3.2 病毒滴度测定将病毒原液连续 10 倍传递稀释后接种于细胞，每日观察病毒感染 Vero 细胞后CPE 的病变情况，72h 记录结果（图 1-3，表 1-1）。
图 1-2 金丝桃素对 Vero 细胞的毒性Fig.1-2 Toxicity of hypericin to Vero cells3.2 病毒滴度测定将病毒原液连续 10 倍传递稀释后接种于细胞，每日观察病毒感染 Vero 细胞后CPE 的病变情况，72h 记录结果（图 1-3，表 1-1）。
本文编号：2840032
【学位单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285
【部分图文】：
第一部分 金丝桃素抗 HSV-1 作用的药效学实验研究第一部分 金丝桃素抗 HSV-1 作用的药效学实验研究材料与仪器药物桃素购于上海源叶生物科技公司，纯度：98%，批号：PAO0408R素用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配成 30mmol/L 母液浓度，用 除菌后存于 4℃避光，使用前用 DMEM 培养基稀释至所需浓度。液相层析鉴定（图 1-1）。注射用阿昔洛韦（ACV），购于湖北潜：1411201。将 ACV 同上的方法配成 30mmol/L 母液浓度，过滤使用前用 DMEM 培养基稀释至所需浓度。实验中所用药物的 DM。
图 1-2 金丝桃素对 Vero 细胞的毒性Fig.1-2 Toxicity of hypericin to Vero cells3.2 病毒滴度测定将病毒原液连续 10 倍传递稀释后接种于细胞，每日观察病毒感染 Vero 细胞后CPE 的病变情况，72h 记录结果（图 1-3，表 1-1）。
图 1-2 金丝桃素对 Vero 细胞的毒性Fig.1-2 Toxicity of hypericin to Vero cells3.2 病毒滴度测定将病毒原液连续 10 倍传递稀释后接种于细胞，每日观察病毒感染 Vero 细胞后CPE 的病变情况，72h 记录结果（图 1-3，表 1-1）。
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