槲皮素促进铁噬缓解酒精性肝铁过载的机制研究

发布时间：2020-10-14 05:45

　　 目的:探讨槲皮素与铁处理对慢加急性酒精摄入诱导的肝铁过载及铁噬紊乱的影响,进而阐明铁噬在酒精性肝铁过载中的作用及槲皮素的拮抗机制。方法:1.动物实验:90只18-20 g成年雄性C57BL/6J小鼠按体重随机分为以下9组:1)正常对照组(C):正常Lieber De Carli液体饲料;2)慢加急酒精模型组(E):乙醇供能28%的Lieber De Carli1液体饲料;3)槲皮素对照组(Q):正常Lieber De Carli液体饲料,灌胃槲皮素100mg/kg.B.W.;4)槲皮素+酒精组(E+Q):槲皮素100 mg/kg.B.W.+乙醇供能28%的Lieber De Carli液体饲料;5)高铁对照组(HI):含羰基铁0.2%的正常Lieber De Carli液体饲料;6)高铁+酒精组(HI+E);7)槲皮素+高铁+酒精组(HI+E+Q);8)低铁对照组(LI):去除饲料中铁的正常Lieber De Carli液体饲料;9)低铁+酒精组(LI+E)。各组小鼠等能量配对喂养,采用慢加急酒精喂养方式建立酒精性肝损伤模型,期间定期记录小鼠体重和摄食量变化。实验结束后采血测定甘油三酯、转氨酶水平;HE和油红染色及酶法观察肝组织病理学改变和脂肪变性;普鲁士蓝染色观察肝脏铁沉积,火焰原子吸收分光光度法检测肝脏总铁和可变铁池(liable iron pool,LIP)水平;western blot分析自噬与铁噬相关蛋白表达,免疫荧光双标观察肝脏铁蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH)和核受体辅激活蛋白4(nuclear receptor coactivator4,NCOA4)的共定位;软件预测分析得出CCAAT增强子结合蛋白β(CCAAT enhancer bingding proteinβ,CEBPβ)和叉头框蛋白1(Forkhead box protein O1,FOXO1)可能是NCOA4的转录因子,同时提取肝组织核蛋白进行验证,免疫组化观察FOXO1的核定位。2.细胞实验:利用腺病毒转染NCOA4(Ad-NCOA4)或空载体(Ad-Null)的HepG2细胞,经酒精(100 mmol/L)或槲皮素(100μmol/L)处理72h后,western blot检测细胞自噬、铁噬水平相关及铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)蛋白的表达,普鲁士蓝染色观察细胞铁沉积,比色法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性。在此基础上,对HepG2细胞在酒精(100 mmol/L)或槲皮素(100μmol/L)处理的同时,加入FOXO1转录活性抑制剂(AS,1μmol/L),72h后荧光探针法检测溶酶体pH变化,CCK-8法检测细胞活力,western blot检测沉默信息调节因子2相关酶1(Sirtuin1,SIRT1)、p-FOXO1、转录因子EB(transcription factor EB,TFEB)、FTL及铁噬相关蛋白的表达。结果:1.等能量配对喂养12周后,所有酒精暴露组小鼠体重明显轻于非酒精喂养组,槲皮素干预后体重稍有回升但差异无统计学意义;慢加急性酒精喂养、高铁处理,尤其是两者联合暴露后小鼠肝体比明显升高,经槲皮素干预后与相应对照组相比肝体比明显回落。2.与正常对照相比,慢加急性酒精喂养后小鼠肝脏脂质蓄积增加,血清和肝组织TG水平以及血清ALT和AST水平分别升高了73.5%(P0.01)、24.5%(P0.01)、116%(P0.01)和162%(P0.01);酒精喂养小鼠同时给予0.2%羰基铁后,上述变化进一步加重,但给予低铁处理则有一定程度缓解;对酒精喂养小鼠和酒精联合高铁喂养小鼠予以槲皮素干预,与相应的单纯模型组和共同喂养组相比,肝脂质蓄积及血清和肝组织TG水平明显降低,血清ALT和AST水平减少。3.与正常小鼠相比,慢加急性酒精摄入后,肝脏总铁、LIP水平和FTL表达分别升高了46.7%(P0.01)、45.7%(P0.01)和1.98倍(P0.01),肝脏LC3II、NCOA4蛋白表达分别减少了72.8%(P0.05)、71.2%(P0.05),p62、FTH蛋白水平分别增高了9.69倍(P0.01)、3.09倍(P0.01),肝脏FTH和NCOA4荧光共定位区域减少;与酒精组相比,酒精联合高铁共同喂养后,上述变化进一步恶化,但酒精喂养小鼠予以低铁处理后上述表现有一定程度的恢复;对酒精暴露小鼠和酒精联合高铁喂养小鼠予以槲皮素干预,与相应的单纯模型组和联合喂养组相比,肝脏总铁、LIP水平及FTL表达明显下降,肝脏NCOA4、LC3II蛋白表达显著增高,p62、FTH水平降低,肝脏NCOA4与FTH的共定位面积明显增多。与正常小鼠相比,单纯槲皮素或低铁处理可明显增加肝脏NCOA4蛋白表达,促进FTH和NCOA4的荧光共定位。与动物结果一致,在腺病毒空载体组,与空载对照相比,酒精处理明显降低HepG2细胞NCOA4、LAMP1蛋白水平,增高p62、FTH和FTL表达,增加细胞内普鲁士蓝铁染色阳性,升高LDH释放水平;与空载酒精组相比,NCOA4过表达的细胞经酒精处理后,LAMP1蛋白水平明显升高,p62、FTH、FTL水平降低,细胞内铁染色阳性下降,LDH释放减少;空载酒精处理的细胞予以槲皮素干预,其效应与NCOA4过表达类似,均能明显缓解酒精诱导的上述改变。4.与正常对照相比,慢加急性酒精摄入可明显增加核CEBPβ表达,降低细胞核FOXO1水平,免疫组化结果显示FOXO1核定位减少;对酒精暴露小鼠予以槲皮素干预,与酒精喂养小鼠相比,肝组织核CEBPβ水平降低,核FOXO1表达增高了77.1%(P0.05),FOXO1核定位增加。5.单独酒精或AS处理,尤其是两者联合处理后,HepG2细胞p-FOXO1表达明显增加,p62、FTH和FTL表达也随之升高,TFEB蛋白表达和细胞活力下降,溶酶体pH升高;然而,AS并没有引起酒精孵育的HepG2细胞NCOA4蛋白表达进一步下降,但AS与酒精联合孵育的细胞经槲皮素干预后,p-FOXO1、p62、FTH和FTL水平均明显降低,TFEB表达升高,溶酶体特异pH荧光标记和细胞活力增加。结论:1.酒精摄入通过降低肝脏NCOA4蛋白和TFEB表达,导致铁噬的启动受阻和溶酶体功能受损,进而诱导继发性的肝铁过载与损伤;槲皮素干预通过提高肝组织NCOA4蛋白和TFEB表达,促进铁噬的启动和改善溶酶体功能,进而拮抗酒精诱导的肝脏铁过载性损伤。2.酒精升高了CEBPβ的表达和FOXO1的磷酸化,降低了FOXO1的核定位,但FOXO1转录抑制却并没有降低NCOA4的表达,提示CEBPβ和FOXO1可能均非NCOA4的转录调控因子,但FOXO1可能参与了TFEB的转录调控。NCOA4转录调控机制仍需进一步探讨。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【文章目录】：
全文缩写词
摘要
Abstract
前言
1 材料和方法
    1.1 实验动物
    1.2 Lieber De Carli liquid液体饲料配方
    1.3 实验仪器
    1.4 主要试剂
    1.5 自配试剂
    1.6 动物饲养
    1.7 细胞实验
    1.8 检测指标及方法
    1.9 NCOA4 转录因子预测
    1.10 质量控制
    1.11 统计学方法
2 结果
    2.1 槲皮素与铁处理对慢加急性喂养小鼠体重及肝体比的影响
    2.2 槲皮素与铁处理对慢加急性喂养小鼠肝脏脂质蓄积的影响
    2.3 槲皮素与铁处理对慢加急性喂养小鼠肝脏损伤的影响
    2.4 槲皮素与铁处理对慢加急性喂养小鼠肝脏铁沉积的影响
    2.5 槲皮素与铁处理对慢加急性喂养小鼠肝脏自噬水平的影响
    2.6 槲皮素与铁处理对慢加急性喂养小鼠肝脏铁噬水平的影响
    2.7 NCOA4 介导的铁噬对HepG2 细胞铁沉积的影响及槲皮素的干预效应..
    2.8 槲皮素对慢加急性喂养小鼠肝脏核FOXO1 水平的影响
    2.9 FOXO1对TFEB表达与溶酶体功能的影响及槲皮素的干预效应
3 讨论
    3.1 慢加急性酒精摄入对小鼠肝铁过载及肝损伤的影响
    3.2 慢加急性酒精摄入对小鼠肝脏FTL和 FTH蛋白表达的影响
    3.3 慢加急性酒精摄入通过降低NCOA4 表达抑制铁噬的启动,进而诱导继发性的肝铁过载与损伤
    3.4 慢加急性酒精摄入降低肝脏TFEB表达使溶酶体功能受损,进而加重对铁噬的抑制
    3.5 槲皮素通过促进NCOA4 表达诱导铁噬的启动,缓解酒精性肝铁过载性损伤
    3.6 槲皮素增加TFEB蛋白表达,改善溶酶体功能,促进铁噬的发生
4 结论
参考文献
综述
    参考文献
附录
致谢

【参考文献】

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本文编号：2840273