山豆根中主要生物碱对免疫性肝损伤小鼠的干预作用

发布时间：2020-10-14 08:23

　　 目的:通过药理学方法,筛选山豆根主要生物碱对免疫性肝损伤小鼠起干预作用的活性成分,再通过分子生物学方法进一步考察主要生物碱对NK细胞及其表面活化型受体NKG2D影响,旨在考察山豆根主要生物碱可通过抑制NK细胞的活化,从而干预免疫性肝损伤作用。方法:采用自动生化仪检测小鼠血清中ALT、AST的含量变化,结合HE染色检测肝脏损伤情况,筛选出山豆根中起干预作用的活性成分氧化苦参碱和槐果碱。通过小鼠血清中ALB、CHE及TP改变、Tunnel染色检测肝细胞凋亡情况、免疫球蛋白水平及炎性因子改变情况,进一步确证氧化苦参碱和槐果碱对免疫性肝损伤小鼠的干预作用。通过流式细胞技术检测NK细胞数及NK细胞表面受体NKG2D和CRACC;免疫印迹(Western bloting)检测NKG2A、NKG2D、DAP10、DAP12;免疫印迹和免疫组化联合检测PI3K、AKT和ERK;以及实时定量基因扩增荧光检测系统(Q-PCR)NKG2A、NKG2D、DAP10、DAP12、PI3K、AKT、ERK、ZAP70和Syk,旨在考察氧化苦参碱和槐果碱干预免疫性肝损伤的相关机制。结果:(1)山豆根中抗免疫性肝损伤的活性成分筛选采用poly I:C/D-GalN诱导小鼠免疫性肝损伤模型为研究对象,以小鼠血清中ALT、AST和病理状态为指标,筛选山豆根中具有对小鼠免疫性肝损伤起到干预作用的生物碱。研究发现,山豆根中氧化苦参碱和槐果碱能显著降低poly I:C/D-GalN诱导小鼠血清中ALT、AST水平(P0.05,P0.01),且高剂量优于低剂量,表明氧化苦参碱和槐果碱可改善poly I:C/D-GalN诱导的小鼠免疫性肝损伤。病理组织学结果表明氧化苦参碱和槐果碱高剂量均能明显缓解polyⅠ:C/D-GalN造成的肝损伤,而两者的低剂量预处理后能轻微减少炎性细胞浸润和组织损伤,苦参碱并不具有上述干预作用。综上,除苦参碱外,氧化苦参碱和槐果碱对小鼠免疫性肝损伤具有保护作用。(2)氧化苦参碱抗免疫性肝损伤作用机制研究通过检测小鼠血清中ALB、CHE和TP。结果显示,模型组ALB、CHE和TP均低于空白组(p0.01);给药组ALB、CHE、TP均上调(p0.01,p0.05),且高剂量优于低剂量。Tunel染色试验结果表明,相比于模型组,实验组可降低肝细胞凋亡。采用ProcartaPlex多重检测考察小鼠血清中TNF-α和IL-18水平以及免疫球蛋白lgG、lgM和lgA浓度,发现给药后,均有所改善(p0.01,p0.05)。结合小鼠肝组织中炎症因子IL-12和INF-γmRNA水平变化,提示氧化苦参碱对免疫性肝损伤具有保护作用。研究采用流式细胞术,发现模型组小鼠肝脏中,NK细胞所占比例比空白组高(p0.01),小鼠脾脏中,NK细胞所占比例低于空白组(p0.05);相较于模型组,给药组小鼠肝脏中NK细胞所占比例低于模型组,且高于空白组(p0.01,p0.05)。小鼠脾脏中,NK细胞所占比例比模型组高,比空白组低(p0.05)。结合文献和实验结果,提示小鼠肝脏中的NK细胞是自身的活化,以及脾脏中NK细胞向肝脏迁移,使其聚集于肝脏,进而导致免疫性肝损伤,而氧化苦参碱能抑制NK细胞的激活及迁移,进而达到干预肝损伤的作用。运用流式细胞术分析得到,模型组NK细胞表面活化性受体NKG2D和CRACC的表达量均高于空白组。给药后,氧化苦参碱组NKG2D的表达明显下调,氧化苦参碱对活化性受体CRACC的作用不明显。同时,采用Western blot和Q-PCR发现,氧化苦参碱对抑制性受体NKG2A的作用不明显。结果提示:氧化苦参碱对免疫性肝损伤的干预作用,可能是通过下调NKG2D的表达来实现。采用Q-PCR,发现poly I:C/D-GalN处理后,NKG2D、DAP10、AKT以及PI3K mRNA水平均升高(p0.01,p0.05);给药后,NKG2D表达降低的同时,DAP10、AKT以及PI3K的核酸水平均降低(p0.01,p0.05);通过Western blot和免疫组化可知,poly I:C/D-GalN处理后,NKG2D的适配体蛋白DAP10及其下游蛋白均升高(p0.01,p0.05);给药后,DAP10及其下游蛋白的表达量均降低(p0.01,p0.05);结果显示:氧化苦参碱可能是通过抑制NKG2D的表达,从而影响DAP10下游蛋白,达到抑制NK细胞活性的作用。(3)槐果碱抗免疫性肝损伤作用机制研究建立poly I:C/D-GalN诱导小鼠免疫性肝损伤模型,考察槐果碱对免疫性肝损伤小鼠的干预作用。研究发现,槐果碱可增加ALB、CHE、TP含量(p0.01,p0.05),降低肝组织中TNF-α、INF-γ、IL-12的mRNA水平(p0.01,p0.05),结合Tunel染色结果,发现槐果碱对免疫性肝损伤具有保护作用。流式细胞技术检测模型组小鼠肝组织中NK细胞数,发现NK细胞所占淋巴总细胞的比例高于空白组;给药后均降低。且给药组NK细胞表面活化型受体NKG2D的表达量低于模型组。通过Western blot和Q-PCR检测,发现模型组DAP12、ZAP70以及Syk均高于空白组(p0.01,p0.05);槐果碱预处理后DAP12、ZAP70以及Syk均降低(p0.01,p0.05);结果提示:槐果碱可通过NKG2D-DAP12通路降低NK细胞的活化,从而达到缓解肝损伤的作用。结论:本研究表明,山豆根中氧化苦参碱和槐果碱能明显改善小鼠肝损伤情况,其作用机制是药物通过抑制NK细胞的活性实现的。
【学位单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

图 1 山豆根中主要生物碱对免疫性肝损伤小鼠生化指标的影响（n=10）注：Control：空白组；PD：模型组；MH：苦参碱高剂量组；ML：苦参碱低剂量组；OH：氧化苦参碱高剂量组；OL：氧化苦参碱低剂量组；SH：槐果碱高剂量组；SL：槐果碱低剂量组。与空白组相比，#p<0.05，##p<0.01；与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01。3.2 主要生物碱对免疫性肝损伤小鼠肝组织的影响肝组织病理学显示（图 2），空白组小鼠肝组织结构清晰完整，肝细胞排列规则，未见细胞变性、坏死和炎性细胞浸润等病理变化。经 polyI:C/D-GalN 刺激后，肝组织有明显的出血性病变。病变表现为小叶坏死，免疫细胞浸润和肝细胞膨胀，坏死和裂解等情况。氧化苦参碱和槐果碱高剂量能明显缓解 polyI:C/D-GalN 造成的肝损伤。而氧化苦参碱和槐果碱低剂量预处理后，能轻微的减少炎性细胞浸润和组织的损伤。同时，苦参碱高剂量和苦参碱低剂量均不能缓解炎性细胞的浸润以及组织的损伤。结果提示，氧化苦参碱和槐果碱可改善 poly I:C/D-GalN 诱导的小鼠免疫性肝损伤的病理变化。

8图 2 山豆根中主要生物碱干预免疫性肝损伤的病理切片观察（HE：200 倍和 400 倍） （n=5）注：Control：空白组；PD：模型组；OH：氧化苦参碱高剂量组；OL：氧化苦参碱低剂量组；SH：槐果碱高剂量组；SL：槐果碱低剂量组；MH：苦参碱高剂量组；ML：苦参碱低剂量组。

图 3 氧化苦参碱对免疫性肝损伤小鼠血清中 ALB、CHE、TP 的影响（n=10）注：Control：空白组；PD：模型组；OH：氧化苦参碱高剂量组；OL：氧化苦参碱低剂量组；与空白组相比，#p<0.05，##p<0.01；与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01。
【参考文献】

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本文编号：2840420