HT29细胞结肠癌干细胞抗原负载免疫细胞及其联合中药的干预研究

发布时间：2020-10-14 08:15

　　 结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,每年世界范围内死于结肠癌的患者约60万。肿瘤干细胞被认为是肿瘤发生、转移和复发的根源,目前尚缺乏对结肠癌HT-29细胞干细胞体内外杀伤作用及机理的系统性研究。中药基于中医理论治疗,在临床上应用已久。基于此,本论文通过体内外实验,系统地研究了结肠癌HT-29细胞干细胞作为特异性抗原负载DC-CIK细胞和中药槐耳颗粒及山药提取物联合DC-CIK细胞体系对结肠癌干细胞杀伤作用及机理。首先,利用磁珠分选方法分选HT29细胞系中CD133~+细胞,进行克隆形成与裸鼠致瘤实验。结果表明,同一接种密度下,CD133~+细胞克隆形成率显著高于CD133~-细胞,CD133~+细胞可致裸鼠成瘤。这些研究验证了CD133分子作为源自HT29细胞结肠癌肿瘤干细胞特异性标志物的可行性。在上述CD133~+细胞作为结肠癌肿瘤干细胞的基础上,制备了3种特异性抗原:(1)构建含有CD133抗原表位AC133编码序列的原核表达质粒,获得纯化的AC133重组蛋白,证实能够使小鼠产生免疫应答,继而构建了AC133慢病毒真核表达载体;(2)结肠癌干细胞总RNA提取物;(3)结肠癌干细胞全细胞裂解物。用上述3种结肠癌干细胞抗原分别负载DC-CIK细胞,体外杀伤HT29细胞及其干细胞,结果显示3种体系细胞杀伤效果均强于无负载的DC-CIK细胞和单独的CIK细胞。此外,研究了中药槐耳颗粒及山药提取物对HT29细胞及其干细胞的杀伤作用。结果显示,槐耳颗粒和山药提取物均可抑制结肠癌HT-29细胞增殖速率,使干细胞(CD133~+细胞)比例明显降低。中药槐耳颗粒及山药提取物联合DC-CIK细胞对HT29细胞及其干细胞的杀伤作用强于单独使用槐耳颗粒及山药提取物。随后,建立了结肠癌干细胞荷瘤裸鼠模型,进行体内药效实验及机理研究。结果表明,上述3种抗原负载DC-CIK细胞体系、中药槐耳颗粒或山药提取物联合DC-CIK细胞体系,及5-Fu联合DC-CIK细胞体系对荷瘤小鼠的抑瘤效果强于单独使用5-Fu、中药槐耳颗粒或山药提取物、无负载的DC-CIK细胞;其发挥作用的机制主要包括CD4~+T、CD4~+T/CD8~+T和Th1型细胞因子升高,PI3K/Akt、Wnt/β-catenin和Notch通路中的关键基因PI3KR1、Wnt1和Notch1的mRNA表达下调,及Bcl-2蛋白表达下调和Bax蛋白表达上调,诱导细胞凋亡。总之,本文通过体内外试验联合证明CD133可以作为源自HT29细胞的结肠癌肿瘤干细胞特异性标志物,其相应抗原负载的DC-CIK细胞体系,以及中药槐耳颗粒或山药提取物联合DC-CIK细胞体系均对结肠癌干细胞具有较好杀伤效果,为其临床应用研究奠定了基础。
【学位单位】：天津大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285.5
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
缩略词表
第1章 文献综述
    1.1 .结肠癌的发病及其防治
        1.1.1 .结肠癌的发病趋势
        1.1.2 .结肠癌的治疗现状
    1.2 .肿瘤干细胞的概念、特征及分选
        1.2.1 .肿瘤干细胞的概念
        1.2.2 .肿瘤干细胞的特征
        1.2.3 .肿瘤干细胞的分离与鉴定
    1.3 .靶向肿瘤干细胞的治疗策略
        1.3.1 .单克隆抗体的治疗
        1.3.2 .靶向肿瘤干细胞信号传导通路、耐药和凋亡的治疗
        1.3.3 .免疫细胞的治疗
    1.4 .中药在恶性肿瘤治疗中的作用
    1.5 .本论文研究目的及意义
第2章 结肠癌HT29细胞干细胞特异性生物标志CD133的鉴定
    2.1 .引言
    2.2 .实验材料与方法
        2.2.1 .实验材料
        2.2.2 .主要实验仪器
        2.2.3 .结肠癌HT29细胞的复苏培养
        2.2.4 .结肠癌CD133~-细胞和CD133~+细胞的分选
        2.2.5 .流式细胞仪检测HT29细胞中干细胞(CD133~+细胞)的比例
        2.2.6 .克隆形成实验检测结肠癌细胞的克隆形成率
        2.2.7.结肠癌细胞裸鼠成瘤实验
        2.2.8 .结肠癌移植瘤组织HE染色
        2.2.9 .RT-PCR检测裸鼠移植瘤中CD133表达
        2.2.10 .统计学分析
    2.3 .结果
        2.3.1 .结肠癌HT29细胞克隆形成实验结果
        2.3.2 .结肠癌细胞裸鼠致瘤实验结果
        2.3.3 .结肠癌裸鼠移植瘤HE染色结果
        2.3.4 .RT-PCR检测裸鼠移植瘤CD133表达结果
    2.4 .讨论
        2.4.1 .肿瘤干细胞的发现
        2.4.2 .肿瘤干细胞的分离与鉴定
    2.5 .本章小结
第3章 负载CD133特异性抗原的DC-CIK细胞对结肠癌干细胞体外杀伤的研究
    3.1 .引言
    3.2 .实验材料与方法
        3.2.1 .实验材料
        3.2.2 .主要实验仪器
        3.2.3 .CD133特异性抗原的制备
        3.2.4 .DC的制备与细胞免疫表型的检测
        3.2.5 .CIK细胞的制备与细胞免疫表型的检测
        3.2.6 .负载CD133特异性抗原的DC-CIK细胞对HT29细胞及CD133~+细胞的体外杀伤实验
        3.2.7 .统计学分析
    3.3 .结果
        3.3.1 .肿瘤干细胞总RNA和全细胞裂解物的制备与鉴定
        3.3.2 .AC133原核表达载体的构建与鉴定
        3.3.3 .AC133重组慢病毒感染结果
        3.3.4 .CIK和DC细胞的形态
        3.3.5 .DC细胞和CIK细胞免疫表型分析
        3.3.6 .负载CD133特异性抗原的DC-CIK细胞对HT29细胞的体外杀伤作用
        3.3.7 .负载CD133特异性抗原的DC-CIK细胞对结肠癌HT29细胞干细胞的体外杀伤作用
        3.3.8 .负载CD133特异性抗原的DC-CIK细胞对结肠癌HT29细胞及其干细胞杀伤活性的比较
    3.4 .讨论
        3.4.1 .肿瘤干细胞特异性抗原的制备
        3.4.2 .AC133重组慢病毒表达体系的构建
        3.4.3 .肿瘤免疫细胞治疗
    3.5 .本章小结
第4章 槐耳颗粒及山药提取物联合DC-CIK细胞对结肠癌HT29细胞中肿瘤干细胞比例的影响
    4.1 .引言
    4.2 .实验材料与方法
        4.2.1 .实验材料
        4.2.2 .主要实验仪器
        4.2.3.细胞毒性实验
        4.2.4 .流式细胞仪检测结肠癌HT29细胞干细胞比例
        4.2.5 .DC-CIK细胞对槐耳颗粒与山药提取物作用HT29细胞前后杀伤作用的检测
        4.2.6 .统计学分析
    4.3 .结果
        4.3.1 .槐耳颗粒和山药提取物对结肠癌HT-29细胞形态的影响
        4.3.2 .槐耳颗粒和山药提取物对结肠癌HT-29细胞增殖抑制的影响
        4.3.3 .槐耳颗粒和山药提取物对结肠癌HT-29细胞干细胞(CD133~+细胞)表达的影响
        4.3.4 .DC-CIK细胞对槐耳颗粒和山药提取物作用HT-29细胞前后杀伤作用的比较
        4.3.5 .DC-CIK细胞对槐耳颗粒和山药提取物作用HT-29细胞前后CD133~+细胞比例变化的比较
    4.4 .讨论
        4.4.1 .槐耳颗粒在恶性肿瘤中的治疗
        4.4.2 .山药在恶性肿瘤中的治疗
    4.5 .本章小结
第5章 负载CD133特异性抗原的DC-CIK细胞、中药及化疗药联合DC-CIK细胞的体内药效研究
    5.1 .引言
    5.2 .实验材料与方法
        5.2.1 .实验材料
        5.2.2 .主要实验仪器
        5.2.3 .建立结肠癌干细胞(CD133~+细胞)裸鼠模型
        5.2.4 .结肠癌干细胞荷瘤裸鼠的免疫治疗
        5.2.5 .流式细胞术检测血清T淋巴细胞亚群
        5.2.6 .ELISA法检测血清细胞因子的含量
        5.2.7 .结肠癌移植瘤组织HE染色
        5.2.8 .免疫组化检测移植瘤组织中Bcl-2与Bax的蛋白表达
        5.2.9 .用 RT-PCR检测相关信号通路关键基因表达水平的变化
        5.2.10 .统计学处理
    5.3 .结果
        5.3.1 .结肠癌裸鼠动物模型
        5.3.2 .荷瘤裸鼠生存状况比较
        5.3.3 .对荷瘤裸鼠抑瘤的影响
        5.3.4 .荷瘤裸鼠T淋巴细胞亚群检测结果
        5.3.5 .荷瘤裸鼠血清细胞因子检测结果
        5.3.6 .荷瘤裸鼠肿瘤病理学检测结果
        5.3.7 .瘤体凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax表达结果
        5.3.8 .信号通路关键基因表达水平的结果
    5.4 .讨论
        5.4.1 .结肠癌治疗面临的挑战
        5.4.2 .结肠癌干细胞荷瘤裸鼠治疗的实验研究
        5.4.3 .荷瘤裸鼠实验作用机制的研究
    5.5 .本章小结
第6章 结论
    6.1 .结论
    6.2 .创新点
    6.3 .展望
参考文献
附录
    附录A
    附录B
    附录C
发表论文获奖和参加科研情况说明
致谢

【参考文献】

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本文编号：2840417