Hederacochiside C抗EV71病毒和白头翁皂苷B4保护急性肾损伤的实验研究

发布时间：2020-10-14 19:46

　　 白头翁为毛莨科植物白头翁Pulsatilla chinensis(Bunge)Regel的干燥根,其味苦、性寒、入大肠经,具有清热解毒、凉血止痢的作用。三萜皂苷类是白头翁的主要有效成分,其中以五环三萜皂苷类化合物Anemoside B4即白头翁皂苷B4(B4)和Hederacochiside C(HSC)为主要代表。本文主要围绕HSC抗肠道病毒71型(EV71)导致的手足口病和B4抗顺铂(CDDP)导致的急性肾损伤(AKI)的药效作用和机制展开研究。(1)HSC作为白头翁皂苷活性化合物,为了探讨其对来自于临床的高致病性EV71病毒的抗病毒活性及其作用机制,本研究建立了体内外药效学评价模型,采用分子生物学技术探讨HSC对EV71感染的人横纹肌肉瘤细胞(RD)中与天然免疫相关的RLR信号通路的调控作用以及细胞线粒体抗病毒的作用。具体实验步骤与实验结果如下。(I)采用单次腹腔注射EV71(10~6 pfu)建立小鼠手足口病模型,HSC(25mg/kg)腹腔注射,连续给药并观察16天。结果发现EV71导致小鼠瘫痪和死亡,而HSC可以改善小鼠的瘫痪情况、提高小鼠存活率。取小鼠的肌肉组织做病理切片和免疫组化,发现EV71组小鼠肌肉纤维断裂、萎缩现象明显、病毒感染标志物VP-1含量显著上升,而HSC组小鼠肌肉中VP-1含量明显减少并改善EV71导致的肌肉纤维断裂、萎缩现象。(II)采用MTT法检测HSC(200μM)对EV71作用于RD细胞的存活率的影响、Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达,结果发现HSC可以提高细胞存活率并使凋亡蛋白cleaved-PARP表达下降、抗凋亡蛋白Bcl-2表达上升。通过稀释计数法测定病毒滴度、Western Blot检测病毒指标蛋白的表达,发现EV71组病毒滴度明显上升、病毒指标蛋白VP-1和3C-Pro的表达显著升高,而HSC可以降低病毒滴度且使病毒指标蛋白表达下降。通过Western Blot检测RLR信号通路相关蛋白MAVS、IRF 3、p-IRF 3、IFN-β的表达,发现HSC明显升高EV71导致的上述蛋白的表达降低,表明HSC可能通过激活RLR信号通路起抗病毒作用。此外,Western Blot的检测结果和免疫荧光结果同时显示,EV71导致线粒体分裂蛋白p-Drp 1表达升高,而HSC使之表达减少;线粒体膜电位检测结果显示,HSC可升高EV71引起的线粒体膜电位降低,这些实验结果说明HSC可使细胞线粒体分裂减少、升高线粒体膜电位从而恢复线粒体动态平衡起抗病毒作用。(2)本研究为了探讨B4的肾脏保护作用,建立体内外药效学评价模型研究B4抗CDDP导致AKI的活性,采用药理学方法探讨B4对CDDP导致AKI的抗凋亡作用及机制。实验步骤和结果如下。(I)采用单次腹腔注射CDDP(15 mg/kg)建立小鼠AKI模型,B4(50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg)腹腔注射,连续给药6天。结果发现CDDP(15 mg/kg)建立起稳定的小鼠AKI模型,小鼠血中尿素氮(BUN)和肌苷(Crea)明显升高,B4(100 mg/kg、200 mg/kg)组小鼠血清中BUN含量比CDDP组明显降低,B4(200 mg/kg)组小鼠血清中Crea含量比CDDP组低。取小鼠肾脏组织行HE染色,光学显微镜下观察肾脏组织病理组织学改变,发现CDDP组小鼠肾脏组织的肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性、蛋白管型、肾小球萎缩等,B4(200 mg/kg)明显减轻以上病理表现,使肾脏损伤评分显著降低。(II)采用MTT法检测B4对CDDP作用于人胚肾上皮细胞(HEK-293)存活率的影响,流式细胞仪检测B4对CDDP诱导的细胞凋亡的影响,发现B4可以提高HEK-293细胞的存活率,抑制CDDP诱导的细胞凋亡,与Western Blot检测结果显示B4组的细胞凋亡标志蛋白cleaved-PARP表达水平降低一致。综上所述,HSC表现出良好的抗EV71病毒的作用,其机制可能与激活RLR信号通路相关,此外,还可能与HSC减少细胞分裂蛋白的表达并恢复线粒体动态平衡有关。B4有良好的抗CDDP导致AKI的作用,其机制可能与下调凋亡蛋白cleaved-PARP有关。
【学位单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

37℃20min，PBS 洗 3 次，每次 2min；滴加链霉素化亲和素试剂，37℃20min，PBS 洗 4 次，每次 5min，DAB 显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜检，每张片随机观察 6 个高倍视野（400×），拍照，用 Image ProPlus 6.0 软件分析计算每张相片的积分光密度值（integrated option density,IOD）。阳性判断以胞浆和或胞膜着咖啡色，且着色明显高于背景或背景不着色而细胞着色者为 VP-1 阳性细胞。2.3 实验结果2.3.1 HSC 对小鼠行为学的影响病毒感染后 EV71 组小鼠多数出现一侧或双侧后肢明显僵直，爬行困难，生长变慢或死亡；HSC 给药组小鼠上述症状明显减轻。与正常组（0 分）相比，EV71 组小鼠平均临床评分（3.5 分）显著升高（#p＜0.05），而 HSC 给药组小鼠平均临床评分为 0.5 分，与 EV71 组相比有显著降低（*p＜0.05）。此外，阳性对照药利巴韦林组小鼠平均临床评分是 4.5 分，该组小鼠健康状况比 EV71 组小鼠差。结果如图 2-1 所示。

图 2-2 HSC 对小鼠存活率的影响（x_ s,n=10）（#，与正常组比较；*，与 EV71 组比较）2.3.3 HSC 对小鼠肌肉组织病理形态改变的影响肉眼观察，正常组小鼠肌肉组织形态如常，紧致有弹性；EV71 组小鼠肌肉萎缩，质地松弛，HSC 给药组小鼠肌肉组织形态健康，有一定弹性。通过光学显微镜观察分析，正常组小鼠肌肉组织中肌肉纤维排列紧密有序，纹理清晰EV71 组小鼠肌肉组织呈现纤维断裂，萎缩现象；HSC 给药组小鼠肌肉组织有明显改善；阳性对照药利巴韦林组小鼠肌肉组织纤维断裂和萎缩现象明显。图 2-3 为在 400 倍光学显微镜下拍摄的肌肉组织。

C 对小鼠存活率的影响（x_ s,n=10）（#，与正常组比较；*，与 EV鼠肌肉组织病理形态改变的影响正常组小鼠肌肉组织形态如常，紧致有弹性；EV71 组小鼠组小鼠肌肉组织形态健康，有一定弹性。微镜观察分析，正常组小鼠肌肉组织中肌肉纤维排列紧密有组织呈现纤维断裂，萎缩现象；HSC 给药组小鼠肌肉组织林组小鼠肌肉组织纤维断裂和萎缩现象明显。图 2-3 为在 织。
【参考文献】

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本文编号：2841096