何首乌饮及其有效成分延缓大鼠大脑皮层自然衰老的作用及机制研究

发布时间：2020-10-14 19:56

　　 脑衰老是机体各系统衰老的先驱表现,在机体衰老中占主导地位,影响各系统的衰老进程。延缓中枢神经系统衰老一定程度上就会减少老年人神经系统退行性疾病(如Alzheimer’s disease、Parkinson’s Disease、Huntington's disease)的发生。由于中枢神经系统的老化和神经退行性疾病病变的不可逆性,尚缺乏有效缓解疾病进展的药物,因此探讨脑老化机理及研发有效延缓脑衰老、保护脑组织的药物,对减少神经系统退行性疾病的发生率,提高老年人生活质量,实现健康老龄化有着重要的科学、经济和社会意义。中医理论延缓脑衰老预防老年疾病的基础治法是补肾健脑法,中药复方基于辨证施治理论,发挥多靶点、多环节的特点,在延缓衰老,预防和治疗中枢神经系统退行性疾病具有良好的前景。近年来衰老机制学和药效学研究已经深入到单味植物药的有效成分,以期较好的避免植物药复杂成分引发的不良反应、研发出有效抗衰老靶点单体药物。补肾健脑方何首乌饮(Heshouwuyin,何首乌15 g,肉苁蓉10 g,淫羊藿10 g,怀牛膝15 g,丹参25 g,茯苓15 g)是近年研究较多的复方,二苯乙烯苷(Stilbene Glucoside,TSG)、苯乙醇苷(Phenylethanoid Glycosides,PhGs)、淫羊藿苷(Epimedium Glycoside,Icraiin)分别是何首乌、肉苁蓉、淫羊藿的主要抗衰老成分,在生殖系统衰老的研究已经初具成效,然其中枢神经系统抗衰老方面有待进一步研究。鉴于何首乌饮与性腺轴相关报道,而下丘脑-垂体-睾丸(卵巢)轴与大脑皮层衰老及功能异常密切相关,本课题对何首乌饮及其有效成分延缓自然衰老大鼠大脑皮层衰老作用及机制进行了研究,为中药延缓中枢神经系统衰老,研发有效抗衰老靶点单体药物、减少老年退行性疾病提供理论参考。第一部分何首乌饮及其有效成分延缓自然衰老大鼠大脑皮层的衰老及机制研究目的:探讨何首乌饮及其有效成分对自然衰老大鼠学习记忆能力、大脑皮层组织衰老,神经细胞凋亡的改善作用,以及其对大鼠大脑皮层氧化应激相关指标、凋亡相关因子表达的影响。方法:将16个月SPF级SD大鼠(雌雄各半)随机分为:自然衰老组(old),二苯乙烯苷组(TSG),苯乙醇苷组(PhGs),淫羊藿苷组(Icraiin),何首乌饮组(Heshouwuyin),每组30只,分别灌胃等量生理盐水、TSG 100 mg/kg、PhGs 100 mg/kg、Icraiin 100 mg/kg和何首乌饮48 g/kg,连续60d,于18月龄进入实验。选取相同来源和相同遗传背景的3月龄SD大鼠30只作为年轻组(young),给予等量生理盐水灌胃1个月,于4月龄进入实验。采用Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力。处死大鼠取脑组织,切片,行HE、SA-β-gal、TUNEL染色。提取大脑皮层组织蛋白,DCFH-DA法检测ROS含量,XOD法检测SOD活性,DNTB法检测GSH-Px活性,TBA法检测MDA含量。RT-PCR法和Western-blot法检测大脑皮层Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA及蛋白表达变化。结果:1.Morris水迷宫检测大鼠的学习记忆能力:在实验第1-5天,与young相比,old组逃避潜伏期明显延长(P0.01)。实验第5天,TSG、PhGs和Heshouwuyin组逃避潜伏期明显少于old组(P0.05);Icraiin组逃避潜伏期缩短,但差异没有统计学意义(P0.05)。old组穿越平台次数比young组显著减少(P0.01);与old组相比,TSG、PhGs组和Heshouwuyin组穿越平台次数明显增加(P0.05);而Icraiin组穿越平台次数无明显差异(P0.05)。2.HE染色:young组大脑皮层神经细胞形态结构清晰,数目较多,突起明显,胞浆染色浅,染色质分布均匀,核形规则。old组神经细胞体积缩小,突起减小,胞浆深染,核形欠规则,染色质有凝集现象。与old相比,四个用药组可见部分神经细胞体积有所增大,突起数量有增加,胞质染色较浅,核形较规则,染色质凝集不明显,分布较均匀,Heshouwuyin组变化明显。3.大脑皮层SA-β-gal染色结果:old组SA-β-gal阳性率比young组明显升高(P0.01);PhGs、Heshouwuyin组SA-β-gal阳性率较old组明显减少(P0.05或0.01)。4.大脑皮层TUNEL染色结果:与young组相比,old组凋亡率明显升高(P0.01);PhGs、Icraiin和Heshouwuyin组凋亡率与old组相比均有明显降低(P0.05)。5.DCFH-DA法检测ROS含量:old组大鼠大脑皮层ROS相对含量比young组明显升高(P0.01);PhGs和Heshouwuyin组ROS相对含量较old组明显降低(P0.05)。6.XOD法检测SOD活性:old组大鼠大脑皮层SOD活性比young组明显降低(P0.01);Icraiin和Heshouwuyin组SOD活性较old组明显升高(P0.05)。7.DNTB法检测GSH-Px活性:old组大鼠大脑皮层GSH-Px活性比young组明显降低(P0.01);Ph Gs、Icraiin和Heshouwuyin组GSH-Px活性较old组明显升高(P0.05)。8.TBA法检测MDA含量:old组大鼠大脑皮层MDA含量比young组明显升高(P0.01);TSG、Ph Gs和Heshouwuyin组MDA含量较old组明显降低(P0.05)。9.RT-PCR、Western-blot法检测结果:与young组相比,old组大鼠大脑皮层中Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表达升高,Bcl-2 mRNA和蛋白表达降低,差异有统计学意义(P0.01);与old组相比,Icraiin和Heshouwuyin组大鼠大脑皮层中Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表达降低,Bcl-2 mRNA和蛋白表达增加,差异有统计学意义(P0.05)。小结:TSG、Ph Gs和Heshouwuyin有助于改善自然衰老大鼠学习记忆能力。四种药物尤其是Heshouwuyin有使大鼠大脑皮层保持年轻形态的趋势。PhGs和Heshouwuyin减少大鼠大脑皮层SA-β-gal的阳性表达。PhGs、Icraiin和Heshouwuyin降低自然衰老大鼠大脑皮层细胞的凋亡。PhGs提高GSH-Px活性,降低ROS和MDA含量;Icraiin提高SOD、GSH-Px活性;Heshouwuyin同时影响以上四个指标,提高自然衰老大鼠大脑皮层的抗氧化能力,以Heshouwuyin作用最佳。Icraiin和Heshouwuyin上调Bcl-2的表达,下调Bax和Caspase-3的表达,抑制细胞凋亡,延缓大鼠大脑皮层自然衰老。第二部分神经元体外自然衰老模型的建立与鉴定目的:摸索体外培养大鼠原代神经元自然衰老的时间规律,确定延长培养至神经元衰老的时间点,建立自然衰老神经元模型。方法:使用Neurolbasal+B27无血清培养基进行SD新生大鼠皮层原代神经元培养,NSE细胞免疫化学染色进行神经元纯度鉴定。在皮层神经元体外培养不同时间点(细胞培养第7、9、11、13、15、17、19、21天),进行活体神经元计数和形态学观察;细胞化学染色法检测神经元SA-β-gal阳性率;TUNEL法检测神经元早期凋亡率;Western-blot法检测神经元Caspase-3蛋白表达;分光光度法检测神经元Caspase-3活性。结果:光学显微镜形态学分析,原代培养神经元第7天,神经元胞体呈锥体形,三角形,梭形,椭圆形,形态饱满,具有典型的轴突与树突。细胞轮廓清晰,结构立体,胞浆均匀一致、胞质透亮,核大而明显。第10天时,构建良好的神经网络。第15天时,神经元数目没有明显变化,形态规整,但出现神经纤维交联,神经细胞聚合的现象。17天以后,活细胞数目锐减,固缩神经元逐渐增多,神经元突起变细、缩短、断裂、模糊,部分呈现串珠样改变。培养基中分泌物及细胞碎片逐渐增加。神经元延长培养第15天时,SA-β-gal的阳性率达到60.56±9.20%,显著高于7-13天;早期凋亡率达到31.48±6.05%,显著高于第7-13天;神经元Caspase-3蛋白表达水平1.27±0.015,为第7天的2倍以上,与第7-13天相比差异显著;神经元Caspase-3活性2.21±0.24,为第7-13天的1.5-2倍以上,差异显著。提示在体外培养的神经元,延长培养时间至第15天时,60%神经元处于衰老状态,30%以上神经元早期凋亡,整个细胞培养体系进入自然衰老阶段。小结:不使用药物诱导与损伤,在Neurolbasal+B27无血清培养体系下,皮层神经元原代培养第15天是神经元培养体系进入自然衰老阶段的时间点,为后继体外神经元药物抗衰老研究提供依据。第三部分何首乌饮有效成分及其配伍体外延缓大鼠皮层神经元衰老的作用及机制研究目的:探讨何首乌饮单味药有效成分(TSG、PhGs、Icraiin)及其配伍(TSG+Ph Gs+Icraiin)对自然衰老神经元形态学、SA-β-gal和TUNEL阳性细胞率、氧化应激相关指标、凋亡相关因子、β-catenin、REST表达的影响,初步比较药物对自然衰老神经元网络构建状况、抗氧化应激能力、衰老与凋亡的作用,分析其延缓神经元自然衰老的作用及机制。方法:Neurolbasal+B27无血清培养基进行SD新生大鼠原代皮层神经元培养。实验分组为(1)短时培养组ST;(2)长时培养组LT;(3)二苯乙烯苷组TSG(50μmol/l);(4)苯乙醇苷组PhGs(50μmol/l);(5)淫羊藿苷组Icraiin(50μmol/l);(6)配伍组TSG+Ph Gs+Icariin(50μmol/l)。ST组为皮层神经元培养第7天,LT组为皮层神经元培养第15天。药物处理组,为皮层神经元培养第12-14天,分别给于TSG、PhGs、Icariin(50μmol/l)和TSG+PhGs+Icariin(50μmol/l)作用72 h后,于第15天固定或收集各组神经元。实验前ST组和LT组同时给于等量加DMSO和PBS的培养基处理72 h。倒置显微镜下观察神经元的形态学变化及生长状况并拍照,做SA-β-gal衰老细胞染色和TUNEL免疫细胞化学染色。提取细胞蛋白,DCFH-DA法检测ROS含量,XOD法检测SOD活性,DNTB法检测GSH-Px活性,TBA法检测MDA含量。使用免疫细胞化学、分光光度法、RT-PCR、Western-blot的方法,检测各组神经元Bcl-2、Bax、Caspase-3和β-catenin、REST表达情况。结果:1.形态学观察:神经元培养第15天,TSG和PhGs组神经元聚合现象明显少于LT组。Icraiin和配伍组神经元未发现聚合现象。培养17-19天,四个用药组固缩神经元均有所减少,可以见到局部存有完整的神经网络结构,尤以Icraiin组变化明显。培养第21天,Icraiin组几乎见不到神经元,细胞碎片满视野;配伍组可以见到结构清晰的神经元。2.神经元SA-β-gal染色结果:与ST组相比,LT组SA-β-gal阳性率显著升高(P0.01);与LT组相比,四个用药组SA-β-gal阳性率明显减少(P0.01)。PhGs组和配伍组神经元蓝染程度明显减轻,提示SA-β-gal表达量减弱。3.神经元TUNEL染色结果:与ST组相比,LT组神经元凋亡率显著升高(P0.01);与LT组相比,TSG组凋亡率无明显降低(P0.05);PhGs组、Icraiin组和配伍组凋亡率明显减少(P0.01),神经元核TUNEL染色明显变浅,提示其表达量减弱。4.DCFH-DA法检测ROS含量:LT组神经元ROS相对含量比ST组显著增加(P0.05)。PhGs、配伍组神经元ROS相对含量比LT组均明显降低(P0.01)。5.XOD法检测SOD活性:LT组神经元SOD酶的活性比ST组显著降低(P0.01)。PhGs、Icraiin、配伍组神经元SOD酶的活性比LT组均明显升高(P0.05或0.01)。6.DNTB法检测GSH-Px活性:LT组神经元GSH-Px酶的活性比ST组显著降低(P0.05或0.01)。PhGs、Icraiin、配伍组神经元GSH-Px酶的活性比LT组均明显升高(P0.01)。TSG组神经元GSH-Px酶的活性比LT组也有增加(P0.05),差异显著。7.TBA法检测MDA含量:LT组神经元MDA含量比ST组显著增加(P0.01)。TSG、PhGs、配伍组神经元MDA含量比LT组均明显降低(P0.01)。8.Western-blot检测Bax、Bcl-2结果:LT组神经元Bax/Bcl-2比值是ST组2倍以上(P0.01)。PhGs组和Icraiin、配伍组神经元Bax、Bcl-2蛋白表达变化明显,Bax/Bcl-2比值明显低于LT组神经元(P0.05或0.01)。9.RT-PCR检测Bax、Bcl-2结果:LT组神经元BaxmRNA相对水平比ST组升高2倍之多,而Bcl-2mRNA表达明显较少(P0.01)。与LT组相比,四个用药组神经元BaxmRNA表达减少,而Bcl-2mRNA表达增加(P0.05);PhGs、Icraiin、配伍组神经元Bax、Bcl-2mRNA数据变化显著(P0.01)。10.免疫细胞化学Caspase-3染色结果:与ST组相比,LT组神经元Caspase-3的蛋白表达阳性率与过阳性率明显升高(P0.01)。与LT组相比,四个用药组神经元Caspase-3过阳性率显著降低(P0.05)。11.分光光度法检测Caspase-3活性结果:LT组神经元Caspase-3的活性为ST组2倍左右(P0.01)。PhGs、Icraiin、配伍组Caspase-3的相对活性显著降低(P0.01)。12.Western-blot检测β-catenin结果:与ST组相比,LT组神经元胞核胞质内β-catenin表达明显增加(P0.01)。LT组神经元胞核β-catenin表达高于胞质,与LT组相比,PhGs和Icraiin、配伍组胞核内β-catenin表达增加,胞质内β-catenin表达显著减少(P0.05)。13.Western-blot检测REST结果:与ST组相比,LT组神经元胞核胞质内REST表达明显增加(P0.01)。LT组神经元胞核REST蛋白高于胞质,β-catenin与REST蛋白共同核内转移。与LT组相比,Icraiin、配伍组胞核内REST表达增加,胞质内REST表达显著减少(P0.05)。小结:四种药物都可以维持神经元的正常形态,显示出抗衰老作用。配伍给药作用时间比较长久,Icariin于衰老早期抗衰老作用显著。四种药物都能减少自然衰老神经元SA-β-gal表达,PhGs、Icraiin、配伍给药都能减少自然衰老神经元的凋亡。自然衰老神经元氧化应激相关指标出现异常,TSG提高GSH-Px的活性,减少MDA含量;Icraiin提高SOD、GSH-Px活性;PhGs、有效成分配伍减少ROS含量,增加SOD、GSH-Px活性,降低MDA含量,增加自然衰老神经元抗氧化应激能力。四种药物通过影响自然衰老神经元Bax、Bcl-2蛋白表达或mRNA表达,减少Bax/Bcl-2比值;降低Caspase-3表达或活性,减少自然衰老神经元的凋亡。Ph Gs、Icraiin和有效成分配伍促进β-catenin和(或)REST的核内转移,通过Wnt/β-catenin信号通路影响自然衰老神经元自我修复和抗氧化应激、抗凋亡能力,延缓神经元的自然衰老进程。结论:在Neurolbasal+B27无血清培养体系下,皮层神经元原代培养第15天可以作为神经元培养体系自然衰老的时间节点。何首乌饮及其有效成分通过提高神经元的抗氧化能力,调节凋亡相关因子表达,改善自然衰老大鼠学习记忆能力,发挥延缓大鼠大脑皮层自然衰老的作用,以Heshouwuyin作用明显。单味药有效成分中Icraiin抗凋亡作用突出;PhGs兼顾抗氧化和抗凋亡作用。PhGs、Icariin和何首乌饮有效成分配伍促进神经元β-catenin和(或)REST的核内转移,通过Wnt/β-catenin通路,延缓神经元的自然衰老进程。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

研 究 论 文41图1-2 何首乌饮及有效成分对自然衰老大鼠大脑皮层形态学的影响（×400）Fig.1-2 Morphological effects of Heshouwuyin and the effective componentson cerebral cortex of natural aging rats(×400)Four drugs have kept the cerebral cortex of old rats in a young morphological trend,especially Heshouwuyin.

神经元HE染色和NSE免疫细胞化学染色Fig.2-1HEstainingandNSEimmunohistochemicalstainingofneurons.Rat

图 2-2A 不同培养时间的神经元数目（×400）Fig. 2-2AThe number of living neurons at different culture time in each highmagnification(×400)80
【参考文献】

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本文编号：2841110