以蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2为靶点的天然产物抑制剂的筛选

发布时间：2020-10-14 21:24

　　 近年来,由于人口老龄化、不良生活习惯、环境污染和传统手段治愈率较低等因素,癌症己成为威胁我们生命健康的重要疾病。然而,很多癌症都缺乏有效的药物治疗。随着分子细胞生物学的发展,分子靶向治疗越来越受到研究人员和临床医生的重视,是一种被广泛研究的有效的癌症治疗方式。临床上已有成功的药物用于个别癌症的治疗,有效延长病人的存活。在癌症的发生与发展中,激酶和磷酸酶扮演者重要的角色。由激酶和磷酸酶介导的蛋白的磷酸化和去磷酸化是基本的细胞信号传导调控方式,通过可逆的磷酸化调控着很多细胞功能,可逆磷酸化的异常会诱发多种疾病产生,如炎症、肿瘤。Shp2是PTPN11基因编码的胞内非受体蛋白酪氨酸磷酸酶,是PTPs家族中的一员,它广泛表达于胚胎和各种成人组织中,参与多种信号通路的调控,如:Ras/Erk、PI3K/Akt、Jak/Stat,从而调控细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等。先前研究证明,Shp2是一个能诱导癌症发生的原癌基因,在白血病、乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌等疾病中,都发现Shp2具有促进作用,Shp2功能获得性突变将引起努南综合征(NS)、豹斑综合征(LS)、青少年粒单核细胞白血病(JMML),而动物实验证明,敲除Shp2基因或抑制Shp2的高活性可以阻滞或延缓肿瘤的发生发展。因此,Shp2是一个很好的药物开发靶点,开发Shp2的抑制剂具有重大的现实意义。为了发现蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2的抑制剂,我们通过利用大肠杆菌系统原核表达出了 Shp2活性催化区(PTP-Shp2蛋白)以及Shp2同家族蛋白Shpl蛋白、VHR蛋白、HePTP蛋白,这些同家族蛋白作为检测我们筛选到的抑制剂是否只特异的抑制PTP-Shp2的参照蛋白。随后我们建立起了基于pNPP(一种蛋白酪氨酸磷酸酶的通用底物)的酶和底物反应的体外高通量筛选模型。首先,利用该筛选模型,从太子参、筋骨草、金线莲、红菇4种中药的共223种内生菌活性成分中,我们筛选发现筋骨草内生菌的一个活性成分(命名为g28)是PTP-Shp2的特异性抑制剂;从鱼腥草等30种中药粗的馏分中,我们筛选发现鱼腥草、蒲公英、肿节风、夏枯草这4种中药粗馏分特异性抑制PTP-Shp2的活性。接下来从329种中药天然单体中我们筛选发现H320(异阿魏酸)和H335(肉桂酸)对PTP-Shp2具有特异的强抑制作用。在细胞水平实验中,通过实验验证,在293T细胞中,H320能够抑制EGF诱导下Shp2依赖的MAPK的活化;先前的研究发现MDA-MB-468细胞的增殖和迁移依赖Shp2,我们用H335处理MDA-MB-468细胞系及Shp2 Q79P稳转MDA-MB-468细胞系后,发现H335能够抑制EGF诱导下Shp2依赖的MAPK的活化,并且能够抑制MDA-MB-468细胞的迁移。因此,我们首次从中药天然单体中发现两种Shp2的特异性抑制剂H320(异阿魏酸)和H335(肉桂酸),通过后续的相关细胞功能研究及结构改造,有望开发成治疗与Shp2相关的癌症的药物。
【学位单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R284
【部分图文】：

—１—??前目??一旦该位点被磷酸化后，则能招募Ｇｒｂ２／Ｓｏｓ复合体至细胞膜，进而使Ｒａｓ／ＭＡＰＫ??通路被激活［７８，７９］。另外，也有研宄证明在应答ＥＧＦ信号中，ＳｈＰ２的第５８０位酪??氨酸也能与Ｇｒｂ２结合，进而活化Ｒａｓ＾ｌ通过这些研究说明Ｓｈｐ２在一些情况下??能够作为一个接头蛋白发挥作用，而不涉及其ＰＴＰ酶的活性。??Ｍｏｄｅｌ?ａ?Ｍｏｄｅｌ?ｂ?Ｍｏｄｅｌ?ｃ??Ｇｒｏｗｔｈ?ｆａｃｔｏｒ?Ｇｒｏｗｔｈ?ｆａｃｔｏｒ??

．会ｐｒ〇Ｕｔｙ?ＭＡＰＫ??图１－２?Ｓｈｐ２参与调控Ｒａｓ／ＭＡＰＫ的三种模型示意图。??Ｆｉｇ．１－２?Ｔｈｒｅｅ?ｍｏｄｅｌｓ?ｐｒｏｐｏｓｅｄ?ｆｏｒ?ｔｈｅ?ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｒａｓ／ＭＡＰＫ?ｂｙ?Ｓｈｐ２．??摘自：Ｍａｔｏｚａｋｉ?Ｔ，?Ｍｕｒａｔａ?Ｙ，Ｓａｉｔｏ?Ｙ，ｅｔ?ａｌ．?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｔｙｒｏｓｉｎｅ?ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ?ＳＨＰ－２：?ａ??ｐｒｏｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｔｈａｔ?ｐｒｏｍｏｔｅｓ?Ｒａｓ?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．?Ｃａｎｃｅｒ?Ｓｃｉ，?２００９，１００（１０）：?１７８６－??９３．??１．２．３．２?Ｓｈｐ２对ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ信号通路的调控??ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ是一条重要的信号通路，可以调节生长因子、细胞因子或激素刺激??下的重要的生物学和病理生理学活动［８１］。在不同的细胞生理条件下，Ｓｈｐ２在??ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ中发挥双重作用，既可以发挥正向调控作用也可以发挥负向调控作用。??类似于Ｓｈｐ２在Ｒａｓ／ＭＡＰＫ途径，Ｓｈｐ２也促进生长因子依赖的ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信??号传导［８２］。Ｋｗｏｎ等发现在平滑肌细胞中，Ｓｈｐ２与ＰＩ３Ｋ的ｐ８５亚基结合，导致??胰岛素样生长因子－１?（ＩＧＦ－１）刺激下的ＰＩ３Ｋ的活化

重悬后进行超声破碎及ＧＳＴ－４Ｂ纯化，然后用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳验证提纯效果。??ＰＴＰ－Ｓｈｐ２、Ｓｈｐｌ、ＶＨＲ、ＨｅＰＴＰ蛋白经１０％的聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行考马??斯亮蓝染色，从图３－１八中可以看出，？丁？４１＾２蛋白与０８丁－４８孵育４小时后，??大部分破碎菌液中的ＰＴＰ－Ｓｈｐ２蛋白均被吸附，随后经过Ｂｕｆｆｅｒ?Ｅ洗脱下来的??ＰＴＰ－Ｓｈｐ２蛋白，分子量大小约为７０ｋＤ，大小符合预期，纯度符合体外高通量筛??选要求。同样的，从图３－１?Ｂ中可以看出原核表达纯化的Ｓｈｐｌ、ＶＨＲ、ＨｅＰＴＰ蛋??白的大小分别约为９４?ｋＤｒ?４５?ｋＤ、６４?ｋＤ，大小符合预期。因此，分离纯化的蛋??白均可以达到体外高通量筛选要求。??Ａ?Ｂ??Ｍａｒｋｅｒ?ＰＴＦ－Ｓｈｐ２?ＰＴＰ－Ｓｈｐ２?ＧＳＴ４Ｂ?吸附后上潘?Ｍａｒｋｅｒ?ＰＴＰ－Ｓｈｐ２?Ｓｈｐ１?ＶＨＲ?ＨｅＰＴＰ??ｉｒｏｋｏｒ＾ＭＷ＾??１７０ｋＤ?１３０ｋ〇ｊ＾Ｐ＜．＞??１３０ｋＤ??７０ＫＤ?７°ｋＤＭＰ＿Ｐ＾??５５ｋＤ?Ｓ５ｋＤ＾Ｗ；；??４〇ｋｄ?４〇ｋＤｐｐ＇??３５ｋＤ?ｆ?３５ｋＤ＿｜｜??２５ｋＤ?｜?＾?２５ｋＤ？：??图３－１考马斯亮蓝染色验证ＰＴＰ－Ｓｈｐ２、Ｓｈｐｌ、ＶＨＲ、ＨｅＰＴＰ的纯化结果。??Ａ．体外分离纯化的ＰＴＰ－Ｓｈｐ２蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳后考马斯染色结果。ＰＴＰ－??Ｓｈｐ２大小约为７０?ｋＤ
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 ;The SHP-2 tyrosine phosphatase: Signaling mechanisms and biological functions[J];Cell Research;2000年04期

本文编号：2841210