中药材半边莲、白花蛇舌草分子鉴定及其复方对阿霉素肾病大鼠药效学研究

发布时间：2020-10-15 00:46

　　 [目的]:基于DNA条形码技术及高分辨率熔解曲线技术分别对复方半边莲注射液中药材原材料白花蛇舌草和半边莲及这两种药材常见伪品做分子检测鉴定,同时研究该复方对阿霉素肾病大鼠相关药效学作用。[方法]:通过提取白花蛇舌草及其常见混伪品基原植物DNA,获取ITS2序列片段并结合GenBank相关下载序列,经CodonCode Aligner软件拼接,利用MEGA软件进行变异位点分析,遗传距离计算和构建邻接(NJ)系统发育聚类树。同时随机检测37份市售药材白花蛇舌草,经中药材DNA条形码鉴定系统进行序列比对并构建邻接(NJ)系统发育聚类树确定物种,鉴别真伪。通过Rotor-Gene Q实时定量PCR仪,基于ITS2序列对半边莲及其常见混伪品及近缘属基原植物进行高分辨率熔解曲线分析,同时对40份市售半边莲药材进行鉴定,通过查看熔解曲线是否与基原植物重合方式鉴定物种,不重合物种将PCR产物测序后进行序列比对鉴定物种。尾静脉一次性注射阿霉素构造SD大鼠肾病模型,将48只雄性大鼠分为空白组、模型组、阳性药组和复方半边莲注射液低、中、高剂量组。进行尿液,血清,及肾脏组织的采集,做病理HE染色及TNF-α和IL-6两个细胞因子免疫组化,对相关指标进行分析。[结果]:白花蛇舌草基原植物ITS2序列种内K2P最大遗传距离远小于其与混伪品种间K2P最小遗传距离,NJ树结果表明白花蛇舌草基原植物可与其混伪品明显区分;市售药材中正品29份,伪品8份,其中半枝莲和远志为新发现的伪品。半边莲与其6种常见混伪品并且与自身3种不同单倍型熔解曲线有明显差异,对市售半边莲40份样品进行检测发现25份属于半边莲单倍型A,5份属于半边莲单倍型B,5份属于半边莲单倍型C,2份为半枝莲,另有3份样品没有与已知的基原植物曲线重合,PCR产物测序后比对发现三个新伪品分别是马唐,黄花蒿。药效研究表明,高剂量组能显著降低尿液中尿蛋白含量,血液中血肌酐、尿素氮、总胆固醇、甘油三酯、总蛋白、血清蛋白与模型组相比均有明显改善,低中剂量组相对效果不显著。HE染色结果表明中高剂量组起到缓解肾硬化及损伤的作用,组化结果表明,IL-6及TNF-α因剂量加大而呈现表达减弱的趋势。[结论]:应用DNA条形码和HRM技术可以对中药原药材白花蛇舌草和半边莲进行快速准确分子鉴定,也为其他中药材原材料鉴定提供了参考与规范,从源头上解决了中药制剂原材料发生混伪,误用现象的发生,保证了用药安全。同时,该复方注射液对有病理学改变的阿霉素肾病大鼠,在适宜药物剂量时,具有明确的治疗效果,为后续其在临床应用研究提供了理论基础。
【学位单位】：黑龙江中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285.5;R282.5
【部分图文】：

整至适当焦距，获得清晰图像，做好记录。??３．?６?ＰＣＲ测序??参照Ｍａｒｋｅｒ上条带位置（图２－１），样品应在相应ＤＮＡ条形码序列??长度位置上出现一条明亮单一的条带，若条带不明显或者不清晰，可以通??过增加ＤＮＡ模板浓度后再次扩增。ＰＣＲ产物直接送到测序公司，应用??Ｓａｎｇｅｒ?测序法原理，使用?ＡＢＩ?３７３０ＸＬ?型测序仪（Ａｐｐｌｉｅｄ?Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ?Ｃｏ．，??ＵＳＡ）进行双向测序。??１９??

品的系统聚类树。从所构建的ＮＪ树中可以看出，白花蛇舌草序列单独聚为??一支，混伪品物种也能单独聚为一支，呈现良好的单系性且自展支持率都??大于９５％?（图２－２）。??、＼?＼！?Ｈ?／?／?／、??％，?＼?＼?＼?＼?＼?１１１?／?／?／?／??＆?、＼＿＼?＼＼?＼?１１?ｆ?ｆ?／?／?／?／?ｙ??７：￥＾歡?ｚ＼??———ｑ?ｆ?＾?二？—一?Ｌ??｜?—＊?——＊?一士?Ｉ?（?Ｉ?＂卜－＿?一－一ｃｏ—歷?ｇ??ｍ??＾ｙｙ／／／?ｎ?ｉ?＼＼＼＼＼＼ｘ??图２－２基于ＩＴＳ２序列构建Ｏ／Ｊｅｎ／ａＷｋ?及其混伪品邻接（ＮＪ?）树??注：Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ?１０００次重复，枝上数值仅显示自展支持率之５０％??２４??

远志（／３〇７７＜§￣３７３?２＾皿／／〇＂３）１份。伪品占抽样调查的２１．６％。根??据以上序列的比对结果，将３７份市场药材（包括新伪品）和前文白花蛇舌??草及其混伪品基原物种的ＩＴＳ２序列一起构建ＮＪ树（图２－３）。结果可以??看出，２９份药材与白花蛇舌草基原聚成一枝，４份与伞房花耳草聚成１枝，??１份与鹅不食草构成一枝，２种新伪品也能单独的聚成一枝，物种鉴定结果??与中药材ＤＮＡ条形码鉴定系统鉴定结果相同，表明基于ＩＴＳ２?ＤＮＡ条形码技??术能很好的鉴定药材白花蛇舌草。??１?Ｍ?＼??Ｗ?Ｉ?？ＶＣ０＿ＴＷ?一一Ｉ?＼?Ｌ＿＂?麗薄??＾?Ｉ?一一二ｉ?＼?卜－：ｓ：：ｒ：：ｖｃｏ一層邱??图２－３基于ＩＴＳ２序列构建的市场药材０／＾／ｅ？／ａ／７ｄ＾ａ?ｃｏｒ＿ｙｍ６ｏｓａ和??己知基原物种的邻接（ＮＪ）树??注：Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ?１０００次重复，枝上数值仅显示自展支持率彡５０％??５．１检索方法举例??中药材ＤＮＡ条形码鉴定系统分为植物类和动物类药材鉴定。其中植??物类药材可以通过ＩＴＳ２或ｐｓｂＡ－ｔｒｎＨ序列进行物种鉴定。??Ｆａｓｔａ格式为生物信息学中表示序列基本格式，序列中Ｒ，?Ｙ，?Ｍ，Ｋ，??２６??
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本文编号：2841440