栀子苷对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠星形胶质细胞的影响

发布时间：2020-10-15 05:11

　　 目的:运用体外分离和培养小鼠大脑皮质星形胶质细胞的方法,研究栀子苷对脂多糖诱导的星形胶质细胞释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的影响,探讨栀子苷对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠星形胶质细胞中枢炎症反应抗炎免疫的分子机制。方法:1.选取出生1-2天的新生ICR小鼠,分离小鼠大脑皮质,经纯化、传代培养得到原代星形胶质细胞,并利用形态学、神经胶质原纤维酸性蛋白免疫荧光鉴定细胞。2.通过形态学观察和CCK-8实验方法,确定LPS作用于星形胶质细胞不同浓度、不同时间,模拟制造合格中枢炎症环境模型。3.通过形态学观察和CCK-8实验方法,检测栀子苷对星形胶质细胞的毒性以及活性的影响,确定最佳用药浓度及作用时间。4.利用酶联免疫法测定栀子苷对LPS诱导的星形胶质细胞分泌炎症因子TNF-α、IL-6的影响。5.实验结果采用SPSS17.0进行数据统计和方差分析。结果:1.原代星形胶质细胞经培养、鉴定后,纯度在95%以上,满足下一步实验要求。2.脂多糖刺激星形胶质细胞后,细胞数量增多,胞体肥大,突起增多。3.LPS组同对照组相比,细胞上清液中IL-6、TNF-α水平显著升高(P0.01),且随着时间延长,呈剂量依赖型增长。4.脂多糖可增强细胞增殖活性,且在作用浓度为1μg/mL,作用时长为24h时效果最好。5.栀子苷浓度在500μmol/L、1000μmol/L、2000μmol/L时使星形胶质细胞的活性下降,产生细胞毒性。6.栀子苷在0.5-100μmol/L范围内对星形胶质细胞增殖活性没有影响。7.100μmol/L以下栀子苷浓度不同孵育时间3h、6h、12h、24h、48h、72h与对照组相比没有显著性差异(P0.05),说明100μmol/L以下栀子苷浓度,作用时间72h以下对星形胶质细胞的活性没有影响,无细胞毒性。8.栀子苷组与模型组比较,1、10、100μmol/L栀子苷作用24h下均能显著下调TNF-α、IL-6炎症因子水平(P0.01),尤以IL-6下降明显。9.100μmol/L栀子苷浓度作用24h下抑制IL-6和TNF-α分泌更为显著。结论:1.脂多糖(1μg/ml,24h)可明显增强细胞增殖活性,并增加炎症因子的释放。2.栀子苷能抑制星形胶质细胞的活性以及降低炎症因子IL-6和TNF-α的释放。
【学位单位】：长春中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

DAPI GFAP Merge图 11 原代培养的星形胶质细胞的形态与纯度。图片为细胞片GFAP免疫荧光染色的结果，图片中绿色代表的是GFAP阳性细胞，即星形胶质细胞；蓝色为DAPI与细胞核结合所呈颜色，代表所有细胞片上的所有细胞核，星形胶质细胞纯度=星形胶质细胞数/细胞总数×100%。N=3;Scalebar=100μm表 1 星形胶质细胞纯度组别星形胶质细胞数(个)细胞总数（个） 细胞纯度（%）1 267 275 97.10 %2 185 193 95.85%3 158 160 98.75%4 102 103 99.02%5 201 210 95.71%

不同浓度 LPS 对星形胶质细胞增殖的影响（0.125μg/mL 浓度作用星形胶质较没有显著性差异（p>0.05），对星形胶质细胞增殖没有影响；0.25、0.5 、L LPS 作用星形胶质细胞 24h 后与对照组相比具显著性差异（p＜0.01），影响。）度LPS对星形胶质细胞分泌IL-6、TNF-α的影响刺激时 IL-6、TNF-α分泌很低，同对照组相比，不同浓度 LPS 作h 后，细胞上清液中 IL-6、TNF-α水平显著升高(P＜0.01)。1μg/mL最为效果明显。结果见表 3，图 13。表 3 不同浓度 LPS 对星形胶质细胞分泌 IL-6、TNF-α的影响(pg/mL, x±浓度（μg/L） IL-6（pg/mL） TNF-α（pg/mL）0 48.24±3.40 356.78±9.57

图 13 不同浓度 LPS 对星形胶质细胞分泌 TNF-α、IL-6 的影响间 LPS 作用对星形胶质细胞活性的影响 LPS 分别作用星形胶质细胞 3、6、12、24、48h 后活性分别为（116±％、（123±4）％、（145±3）％、（158±9）％，与对照组相比，>0.05）；6h 组有差异（p<0.05）；12、24、48h 组有显著性差异（P细胞活性呈增长趋势，但在 48h 组中细胞密度大于 90%，接下来细长，不利于实验结果的准确，因此后续实验造模过程中选用 24h 时见图 14，表 4。表 4 不同时间 LPS 作用对星形胶质细胞活性的影响 (%, x±s)时间(h) 细胞存活率0 100±1
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本文编号：2841747