长白山区药用植物DNA条形码数据库构建及两种中成药生物组分监测研究

发布时间：2020-10-16 04:40

　　 本草基因组学(Herbgenomics)是利用组学技术研究中药基原物种的遗传信息及其调控网络,从组学水平研究中药及其与人体相互作用,阐明中药预防和治疗人类疾病的分子机制的前沿学科,其主要研究内容涉及理论体系、关键技术及实践应用等方面。本研究将DNA条形码鉴定、宏基因组测序和单分子测序等关键技术应用于中药鉴定领域,构建长白山区药用植物DNA条形码数据库并建立中成药质量控制新方法。中药材DNA条形码分子鉴定需要强大的数据库作为支撑,并持续进行数据更新、扩充及维护;中成药质量参差不齐,《中国药典》现行方法难以满足当前对中成药生物组分监测需求,因此迫切需要建立中成药质量评价新方法。本研究基于本草基因组学的关键技术,采用不同测序平台对长白山区药用植物及中成药进行鉴定,主要研究内容及结论如下:1.建立长白山区药用植物DNA条形码数据库:长白山区是北半球同纬度地区保存比较完好的生态系统,是我国北方药用植物资源分布较为集中的区域,也是东北亚地区最大的药用植物种质基因库。对长白山区药用植物资源进行调查,共收集来自107个科400个属678个物种总计1,877份样本。有19个属采集到5个以上物种,随机筛选其中8个属共计55个物种158份样本,比较ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL四种最常用DNA条形码序列的鉴定效率,确定以ITS2和psbA-trnH序列为主体构建长白山区药用植物DNA条形码数据库。实验获得ITS2、psbA-trnH序列各1,736条、1,665条,均经BLAST比对判定其准确性,并纳入上述数据库。该数据库是基于国家自然保护区建立的首个药用植物DNA条形码数据库,能为用户提供长白山区分布药用植物基本信息检索、DNA条形码序列BLAST比对及物种鉴定等功能,对于保护长白山区生物多样性具有重要意义。与“中药材DNA条形码鉴定系统”相比,本研究收集的样本中有38.3%的物种(264种)为新增物种,能够丰富现有DNA条形码数据库,更好地发挥中药材DNA条形码分子鉴定技术对中药材流通市场的监管作用,为海关出入境检验检疫及食品药品监督管理机构提供有效工具,从源头保证临床用药安全。2.建立基于鸟枪法宏基因组测序的中成药生物组分监测方法:收集龙胆泻肝丸处方各味药材作为对照,经性状鉴别及DNA条形码鉴定以确保对照药材均为正品;依照《中国药典》规定方法在实验室自制龙胆泻肝丸对照样本2份(RF01-02),RF02加入人参作为阳性对照;另购买3份市售样本(LDXGW01-03)。分别提取上述样品基因组DNA,构建PCR Free文库,采用Illumina HiSeq 2500平台进行鸟枪法宏基因组测序。原始数据过滤后去除低质量测序reads,高质量测序reads比对ITS2、psbA-trnH和matK数据库,成功比对的测序reads拼接后,获得待检中成药样品DNA条形码序列;在“中药材DNA条形码鉴定系统”中对所得序列进行BLAST比对,获得物种鉴定结果;此外,依照《中国药典》规定方法对龙胆泻肝丸有效成分进行薄层色谱鉴别及含量测定。本研究共获得100 G原始数据,经拼接过滤后得到261个对照及市售样品ITS2,psbA-trnH和matK序列contig。分析结果显示ITS2序列鉴定效率最高,2份对照样本均能够成功检出龙胆泻肝丸处方规定的全部物种,且RF02能够检出阳性对照药材人参,证明该方法具备良好的准确性、稳定性和重复性。市售样品经薄层色谱鉴别及含量测定均符合《中国药典》规定,然而宏基因组测序结果显示市售样品采用川木通药材(Clematidis Armandii Caulis)替代处方规定的木通药材(Akebiae Caulis)。综上,基于鸟枪法宏基因组测序的中成药生物组分监测方法,能够精准监测中成药物种组成,是对复杂组方中成药质量控制方法研究的新突破。3.建立基于SMRT测序的中成药生物组分监测方法:购买九味羌活丸组方各味药材作为对照,经性状鉴别及DNA条形码鉴定以确保对照药材均为正品。依照《中国药典》规定方法将上述中药材粉碎并混合均匀,制成九味羌活丸对照样本2份(RF01-02),RF02加入人参作为阳性对照;购买3份市售样本(JWQHW01-03)。提取上述样品基因组DNA,扩增其ITS2和psbA-trnH序列,扩增产物经纯化后进行SMRT测序及数据分析,所得序列在“中药材DNA条形码鉴定系统”中进行物种判定。SMRT测序共获得518.6 M数据,经过滤后获得可用于后续分析的ITS2和psbA-trnH序列环状一致性测序reads(CCS reads)分别为5,416条和4,342条。物种判定结果显示2份对照样本均能够检出组方中除苍术、白芷外的七味药材,与Sanger测序结果一致,且RF02检出阳性对照药材人参,显示该方法具备良好的准确性、稳定性和重复性。市售样本JWQHW01-03均未检出地黄、白芷,此外,JWQHW02还未检出黄芩;研究还发现,市售样本ITS2和psbA-trnH序列CCS reads比对到27科47属和12科18属其他物种,如JWQHW02中检出白术(Atractylodes macrocephala),而当归属(Angelica)、前胡属(Peucedanum)物种在市售样本中均被检出,显示该方法能够有效检出混淆品及其他杂质。本研究表明该方法适用于中成药生产加工全流程的质量监控,为修订中成药质量控制方法提供新思路,推进《中国药典》中成药质量标准研究。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R284;S567
【部分图文】：

第二章长白山区药用植物ＤＮＡ条形码数据库构建??长白山脉是松花江、鸭绿江和图们江三江发源地，是欧亚大陆东缘的最高山系。??广义的长白山脉包含我国黑龙江、吉林、辽宁三省东部山区，而狭义的长白山则是??指长白山主峰附近的山脉。长白山是处于休眠期的活火山，其地貌自下而上由玄武??岩台地、玄武岩高原和火山锥体三部分构成，火山口由１６座奇峰环绕，形成天池??及瀑布等景观，其中最高峰为白云峰，海拔２，６９１?ｈｌ长白山自然保护区成立于１９６０??年，位于吉林省东南部，东经１２７°?４２＇５５＂?－?１２８°?１６＇４８＂，北纬４１°?４１＇４９”－４２°??２５’１８＂范围内，毗邻朝鲜民主主义人民共和，１］。１９８０年，联合国教科文组织（Ｕｎｉｔｅｄ??Ｎａｔｉｏｎｓ?Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ，?Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ?ａｎｄ?Ｃｕｌｔｕｒａｌ?Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，?ＵＮＥＳＣＯ）正式批准其力口入??国际生物圈保护区网，成为世界自然保留地之一，是“人与生物圈计划”的重要组??成部分，并于１９８６年晋升为国家级自然保护区，占地１９６，６１８公顷［２］，森林覆盖率??超８０％，是典型的山地森林保护区。??

本研究采用鸟枪法宏基因组测序对２份龙胆泻肝丸对照样本及３份市售样本进??行测序。其中，各样本基因组ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳及Ａｇｉｌｅｎｔ?２１００检测结果见图??３－１、图３－２。自ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ?２５００测序平台获得大于１００Ｇ的原始数据，总计超??过７＿５亿个ｒｅａｄｓ?（表３－５），序列覆盖度及ｍａｐｐｉｎｇ结果见表３－６，经拼接和过滤后，??获得ＩＴＳ２、和顯汰序列ｃｏｎｔｉｇｓ共计２６１个（表３－７）。??ｄｉｇｅｓｔ?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ??＿＿ｂｐ??１＾＊１一２３１３０??＾９４１６??６５５７??４３６１??隱１１??图３－１龙胆泻肝丸各样本琼脂糖凝胶电泳图??Ｆｉｇｕｒｅ?３－１．?Ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｆｉｖｅ?ＬＤＸＧＷ?ｓａｍｐｌｅｓ??１－５：?ＬＤＸＧＷ０１

Ａ?Ｂ?Ｃ?Ｄ??图３－３市售龙胆泻肝丸样本中龙胆苦苷、栀子苷及甘草对照药材薄层色谱图??Ｆｉｇｕｒｅ?３－３．?ＴＬＣ?ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?ｇｅｎｔｉｏｐｉｃｒｉｎ，?ｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ，?ａｎｄ?Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅ?Ｒａｄｉｘ??ｅｔ?Ｒｈｉｚｏｍａ??Ａ．?Ｇｅｎｔｉｏｐｉｃｒｉｎ?Ｂ．?Ｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ??Ｃ．?Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅ?Ｒａｄｉｘ?ｅｔ?Ｒｈｉｚｏｍａ，?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｕｎｄｅｒ?ｓｕｎｌｉｇｈｔ??Ｄ．?Ｇｌｙｃｙｎ＊ｈｉｚａｅ?Ｒａｄｉｘ?ｅｔ?Ｒｈｉｚｏｍａ，?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｕｎｄｅｒ?ＵＶ?ｌｉｇｈｔ?（３６５?ｎｍ）??１．?ｔｅｓｔ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ＬＤＸＧＷＯ?１??２．?ｔｅｓｔ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ＬＤＸＧＷ０２??３．?ｔｅｓｔ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ＬＤＸＧ?Ｗ０３??４．?ｃｈｅｍｉｃａｌ?ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ?ｓｕｂｓｔａｎｃｅ?（ＣＲＳ）?［Ａ，?Ｂ，?ａｎｄ?Ｃ］?／?ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ?ｄｒｕｇ?（ＲＤ）?ｓｏｌｕｔｉｏｎ?［Ｄ］??５．?ｔｅｓｔ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ＬＤＸＧＷ０１＋ＣＲＳ?［Ａ．?Ｂ，?ａｎｄ?Ｃ］?／?ＲＤ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ?［Ｄ］??

本文编号：2842776