中药痹祺胶囊主要成分在大鼠体内的代谢研究

发布时间：2020-10-16 19:39

　　 中药及其复方是中华民族的瑰宝,是我国研发自主创新性新药的重要源泉。基于现代生命科学基础研究成果和先进分析技术,诠释中药物质基础和作用机制,特别是药效物质基础和活性作用机制研究有了长足的进步。中药“痹祺胶囊”系汉朝名医华佗的传世验方,主要用于治疗风湿、类风湿关节炎、肩周炎、颈椎病等属于中药“痹症”类疾病,在临床上应用广泛,疗效确切。但由于有马钱子入药,其安全性一直受到临床大夫和监管部门的关注。本论文配合安全性评价,开展了伴随毒代动力学研究,揭示了痹祺胶囊有效成分同时也是毒性成分的马钱子碱和士的宁在大鼠血浆中的药代动力学特点,阐明其暴露量与剂量的关系。利用现代分析技术对痹祺胶囊在大鼠体内主要暴露成分及其代谢产物进行了深入分析和鉴定,进而运用反向分子对接技术对痹祺胶囊在大鼠血中主要暴露成分及其代谢产物进行预测分析,探究可能的作用靶点以及作用途径,为痹祺胶囊临床合理用药提供科学依据。首先建立测定大鼠血浆中马钱子碱和士的宁含量的快速液相色谱-串联质谱(RRLC-MS/MS)分析方法并进行全面验证。方法验证结果表明,该方法线性范围宽(马钱子碱0.025-25ng/mL,士的宁0.25-250ng/mL),线性良好(r0.999),最低定量限为马钱子碱0.025ng/mL,士的宁0.25ng/mL。质控样品日内、日间精密度RSD均小于14.2%,准确度在90.0-109%之间。马钱子碱和士的宁的提取回收率分别为90.7-107%和95.9-103%,基质效应分别为94.7-104%和99.0-113%。长期稳定性和冻融稳定性实验均证明在实验过程中血浆样品能够保持稳定。方法验证结果表明所建立分析方法符合生物样品分析方法指导原则的要求,能够满足大鼠血浆中马钱子碱和士的宁含量测定结果准确可靠的要求。采用所建立的方法测定伴随毒代动力学研究采集的血浆样本中马钱子碱和士的宁的含量,计算获得相关毒代动力学参数。动物实验共设置3个痹祺胶囊给药剂量组,给药剂量分别为0.4g/kg,0.8g/kg和1.6g/kg,连续灌胃给药3个月,每天给药1次。毒理学实验结果表明各个给药剂量组均未见与药品明确相关的毒性反应,未见明显毒性反应剂量(NOAEL)为1.6g/kg。伴随毒代动力学研究结果表明,马钱子碱和士的宁在大鼠体内暴露量随剂量的增加而增高,AUC、Cmax随剂量的增加而显著增大(P0.01),雌雄大鼠的毒代动力学特征不同,提示临床上用药剂量应该考虑性别差异;长期经口服给药痹祺胶囊,马钱子碱和士的宁在大鼠体内有蓄积倾向(蓄积因子RCmax在2.54-4.89之间),提示应合理控制临床用药剂量,制定合理给药周期十分必要。然后运用高效液相-高分辨质谱联用法(HPLC-LTQ/FTICRMS/MSn)分析了痹祺胶囊内容物以及大鼠灌胃给药痹祺胶囊后尿液、粪便、胆汁、血浆样本,采集了保留时间、一级高分辨质谱数据和多级质谱数据。采用适用于复杂生物样本中代谢产物发现和鉴定的数据后处理技术质谱树状图相似度过滤(MTSF)技术,对大鼠灌胃给药痹祺胶囊后尿液、粪便、胆汁、血浆中的原型成分和代谢产物进行分析和鉴定。在痹祺胶囊内容物中检测出23种主要化学成分,包括生物碱类成分7种,皂苷类成分5种,酚酸类成分2种,内酯类成分2种,甾酮类成分2种,菲醌类成分2种,黄酮类成分2种,糖类成分1种。在大鼠的尿液、粪便、胆汁、血浆样品中共发现了痹祺胶囊的16个原型成分(生物碱类3种,皂苷类5种,内酯类2种,甾酮类2种,菲醌类2种,黄酮类1种,糖类1种)和56个代谢产物(生物碱类20种,皂苷类2种,内酯类22种,甾酮类2种,菲醌类1种,黄酮类9种),包括在大鼠尿液中发现了 8个原型成分和32个代谢产物,在粪便中发现了 12个原型成分和17个代谢产物,在胆汁中发现了 6个原型成分和17个代谢产物,在血浆中发现了 13个原型成分和8个代谢产物。针对痹祺胶囊在大鼠血中44种暴露成分(包括15种生物碱类成分,6种皂苷类成分,9种内酯类成分,2种甾酮类成分,3种菲醌类成分,8种黄酮类成分,1种糖类成分),利用PharmMapper数据库,反向分子对接筛选其作用的潜在靶点,通过KEGG数据库将获取的潜在靶点映射在类风湿关节炎疾病相关通路中,确定作用靶标。最后采用Cytoscape软件构建痹祺胶囊治疗类风湿关节炎的“化合物-靶点-通路-疾病”网络药理图。预测的结果表明,38个活性成分(包括15种生物碱类成分,6种皂苷类成分,4种内酯类成分,2种甾酮类成分,3种菲醌类成分,7种黄酮类成分,1种糖类成分)与31个靶点蛋白在6条类风湿关节炎疾病相关通路中起到至关重要的作用。君药马钱子含有最多的活性成分(15种),关联到更多的靶点蛋白(28个)以及信号通路(6个),为中药复方的多成分、多靶点、多途径作用机制探索提供了可行的技术手段。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

Ｆｉｇｒｕｅ?２－２?ＴＩＣ?ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｌｕｍｎｓ．??Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ?１－３?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ?ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ?Ａ，?ｂｒｕｃｉｎｅ，?ｓｔｒｙｃｈｎｉｎｅ．??其次，如Ｆｉｇ．２－３所示，在分析方法中选用０．２％甲酸水溶液－乙腈体系作为流动??相，其中乙腈作为有机相，原因是乙腈相较于甲醇而言具有更大的洗脱强度，从而??可以减少色谱峰的展宽，得到良好的峰型。此外，使用乙腈进行洗脱，粘度较低，??可以减少系统压力。在水相中加入０．２％甲酸，可以改善化合物的峰型，减少拖尾现??象，此外，还可以提高样品在离子源中的离子化效率。??Ａ?Ｍｏｂｉｌｅ?ｐｈａｓｅ?Ａ?＝?ｗａｔｅｒ?２??Ｍｏｂｉｌｅ?ｐｈａｓｅ?Ｂ?＝?ｍｅｔｈａｎｏｌ?ｆ＼??ｉ?Ｇ?ｈ?Ｍｏｂｉｌｅ?ｐｈａｓｅ?Ａ?＝?ｗａｔｅｒ?２??Ｍｏｂｉｌｅ?ｐｈａｓｅ?Ｂ?＝?ａｃｃｔｏｎｉｔｒｉｌｃＡ??，，?上?／??

?第二章痹棋胶囊中马钱子碱和士的宁在大鼠体内的伴随毒代动力学研宄???最后，为消除共同洗脱出的内源性物质对目标化合物离子化过程产生的影响，??对洗脱梯度进行了如下的调整：０－５?ｍｉｎ，５－３０％?Ｂ；?５－７?ｍｉｎ，３０％?Ｂ调整为０－５?ｍｉｎ，??５－８％?Ｂ；?５－７?ｍｉｎ，８％?Ｂ，使得内源性化合物保留在柱子上，消除基质效应的影响（马??钱子碱和士的宁的相对基质效应由７６．１－９１．０％改善为９４．７－１１３％）。然后，在下个分??析批开始前，加入清洗柱子的程序将内源性化合物洗脱下来，最终，每个样品的分??析时间为１１?ｍｉｎ。??４．１．２内标的选择??根据内标法定量中对内标化合物的相关要求，应充分考虑内标化合物和目标测??定化合物在化学结构、色谱行为、离子化程度是否存在相互抑制等诸多因素。通过??比较不同的生物碱类化合物（他克林，石杉碱甲以及乌头碱），结果如Ｆｉｇ．２－４所示，??最终选择石杉碱甲为内标。它的保留时间与目标测定化合物马钱子碱和士的宁接近，??在ＥＳＩ正离子模式下有很好的电离，且不会被血浆基质中的干扰物质抑制。??

２０?２５?３０?３５?４０?４５?５０?５５?６０??Ｃｏｉｔｉｏｎ?Ｅｎｅｒｇｉｅｓ?（ｅ＇．７）??图２－６?士的宁、马钱子碱和石杉碱甲在不同ＣＥ电压下的峰面积（ｎ＝３）??Ｆｉｇｕｒｅ?２－６?Ｔｈｅ?ｐｅａｋ?ａｒｅａ?ｏｆ?ｓｔｒｙｃｈｎｉｎｅ，?ｂｒｕｃｉｎｅ?ａｎｄ?ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ?Ａ?ａｔ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ??ｅｎｅ
【参考文献】

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本文编号：2843687