银杏中抗气道炎症活性成分及其作用机制研究

发布时间：2020-10-16 19:47

　　 近几十年来,典型的气道炎症疾病如慢性肺阻塞(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)、哮喘和肺纤维化的患病率急剧上升。常用药物如糖皮质激素(地塞米松)等具有较强的毒副作用。因此,开发具有一定疗效且安全无副作用的中草药或功能食品,将是一条有效的防治呼吸道炎症的途径。本文对具有平喘止咳效果的中草药进行筛选,最终聚焦于银杏。在中国古代,银杏(Ginkgo biloba)的叶和种子就有用于治疗喘咳的记载。其中,《本草纲目》记载,银杏叶主治温肺益气,定喘咳;《中国药典》中记载,银杏敛肺平喘,用于治疗肺虚咳喘等症状,归心、肺经。但现代研究有关银杏对气道炎症作用的报道较少。本研究主要探讨银杏治疗气道疾病的效果及其物质基础,并阐明活性物质的作用机制。首先,比较不同的银杏提取物对卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)致敏小鼠的抗气道炎症的效果,再利用HPLC-MS和虚拟筛选技术寻找银杏中潜在的抗气道炎症活性成分;研究探讨了银杏中活性成分如何作用于气道炎症的相关靶点,阐明了活性成分对气道炎症中相关通路的影响;其次,对有效提取物的安全性进行评价,最后对活性成分的制备工艺进行了研究,取得的主要研究结果如下:(1)采用卵清蛋白致敏小鼠,造模后小鼠各炎症因子指标大幅度上升。观察不同银杏提取物(银杏叶乙醇提取物,银杏果乙醇提取物,标准银杏叶提取物,银杏叶乙酸乙酯提取物,银杏黄酮提取物以及银杏内酯提取物)对气道炎症模型小鼠的效果。以肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的炎症因子等为参考指标,结果表明,银杏叶乙酸乙酯提取物能明显降低BALF中炎症因子的浓度,在各类提取物中效果最佳。(2)采用HPLC-MS分析发现,银杏叶乙酸乙酯提取物中主要成分为白果黄素、银杏黄素、异银杏黄素和紫杉双黄酮这四种银杏双黄酮。动物试验显示:除去银杏双黄酮后,银杏叶乙酸乙酯提取物的抗气道炎症活性明显下降,说明银杏叶乙酸乙酯提取物中的抗气道炎症的活性成分主要为银杏双黄酮。利用PharmMapper预测四种银杏双黄酮在人体内对肺部疾病的潜在作用靶点,发现其可能的作用靶点主要为人中性粒细胞弹性蛋白酶(Human neutrophil elastase,HNE)。粒细胞弹性蛋白酶是一种强力的中性粒细胞趋化剂,能导致炎症细胞在肺部募集与浸润,同时引起气道黏液蛋白的高表达,在气道炎症的发生过程中起着重要的作用。利用AutoDock进行虚拟对接,结果显示,银杏黄素与HNE自由结合能为-6.69 kcal/mol,目前唯一上市的HNE抑制剂西维来司钠为-5.36 kcal/mol。虚拟筛选结果表明,银杏双黄酮是一种良好的HNE抑制剂。进一步利用荧光色谱和圆二色谱对银杏黄素在体外抑制HNE的活性进行评价,银杏黄素与HNE结合后能导致HNE蛋白荧光淬灭,其IC_(50)为40.8 nmol/L。圆二色谱观测到银杏黄素与HNE蛋白结合后HNE的蛋白构象发生改变。以上实验表明,银杏双黄酮在体外具有抑制HNE的生理活性。(3)采用细胞模型和动物模型对银杏双黄酮抗气道炎症机理进行研究,发现银杏双黄酮能减少由HNE导致的A549细胞中黏液蛋白5AC(Mucin 5AC,MUC5AC)基因的高表达,能抑制HNE处理A549细胞后p38与Akt通路的磷酸化,从而抑制IL-8mRNA的表达。对银杏双黄酮进行纯化,以卵清蛋白致敏小鼠为模型进行灌胃试验。结果显示,随着银杏双黄酮灌胃剂量增加,与中性粒细胞弹性蛋白酶相关的指标IL-8、黏液蛋白(MUC5AC)的表达以及中性粒细胞数目均减少。以上结果表明,银杏双黄酮能抑制中性粒细胞弹性蛋白酶的活性,使气道黏液蛋白分泌减少、炎症因子IL-8降低,从而减轻肺部炎症细胞浸润,达到抑制气道炎症的效果。(4)对银杏叶乙酸乙酯提取物进行安全性评价(50 mg/kg·bw;500 mg/kg·bw;2000 mg/kg·bw),发现小鼠肝肾相关的指标均正常,LD_(50)大于2000 mg/kg,表明银杏叶乙酸乙酯提取物未发现急性毒性。(5)对标准银杏叶提取物(EGB761)的提取工艺进行研究,发现银杏双黄酮成分在EGB761中被完全剔除,这也解释了中医古籍记载银杏有止咳平喘功效而现代文献却很少报道EGB761具有抗气道炎症作用的原因。因此,本文研发了一条全新的银杏资源高值化利用技术及工艺,该技术在不改变原有标准银杏提取物(EGB761)提取工艺的同时,还能同步提取得到高含量的银杏双黄酮提取物,四种银杏总双黄酮含量为87.31%,总双黄酮的收率为56.92%。综上,本文主要研究发现了银杏中抗气道炎症的活性成分,并阐明其作用机制,同时,还研发了活性成分的制备工艺,为后续进行银杏资源高值化利用,开发防治气道炎症的功能食品和药品提供了重要理论和实验依据。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R284;R285
【部分图文】：

图 1.1 哮喘免疫机制中各免疫炎症因子、抗原及相关受体作用图Fig 1.1 Different inflammatory cytokines, antigens and relevant receptors in Asthma由于细胞因子的多源性、多向性以及多功能性，对气道炎症中的众多的细胞因子的分类十分困难。目前，按气道炎症的发病机制和这些细胞因子的特点可将它们分类如下：淋巴细胞因子：IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-8、IL-13、IL-15、IL-16 和 IL-17；致炎细胞因子：IL-1、TNF、IL-6、IL-11、GM-SCF 和 SCF；抗炎细胞因子：IL-10、IL-1ra、INF-γ、IL-12 和 IL-18；趋化因子：RANTES、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、MIP-1 、eotaxin和 IL-8；生长因子：PDGF、TGF-β、FGF、EGF 和 IGF。T 淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞和中性粒细胞浸润是气道炎症

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文化学成分，van Beek, T. A 等[75, 76]也给出了银杏叶中已报道的主要化学物质。这学物质主要包括黄酮类、萜内酯类、烷基酚类、原花青素、羧酸类、杂环类化、聚烯戊醇、植物甾醇，类胡萝卜素等。下面对这些报道的物质的化学结构与的药理作用进行进一步的说明。.2.2.1 银杏中黄酮类化合物的化学结构与药理作用银杏黄酮包括三种黄酮苷元、异黄酮染料木素和双黄酮类及其相应的糖苷。结构如下图 1.2 所示。

图 2.2 不同给药组 OVA 致敏-激发小鼠肺组织出现显著的炎症细胞浸润。其中空白组（NC）不进行雾化激发，模型组（PC）进行雾化激发，灌胃生理盐水。其他给药组分别是地塞米松组：记为 DEX；银杏标准提取物低剂量组，灌胃 10 mg/kg bw 的标准银杏提取物 EGB761（EGB-L）；银杏标准提取物高剂量组，灌胃 40 mg/kg bw 的标准银杏提取物 EGB761（EGB-H）；银杏叶乙酸乙酯提取物组，灌胃 10 mg/kg bw 的银杏叶乙酸乙酯提取物（EAEG）；银杏内酯提取物组，灌胃 10 mg/kg bw 的银杏内酯提取物（ETTL）；银杏总黄酮提取物组，灌胃 10 mg/kg bw 的银杏总黄酮提取物（ETFG）；银杏叶醇提取物组，灌胃 10 mg/kg bw 的银杏叶醇提取物（FEGL）；银杏果醇提取物组，灌胃 10 mg/kg bw 的银杏果醇提取物（FEGS）。箭头所指为炎性细胞灶性浸润。所有图片标尺均为 50 μm。Fig 2.2 Significant infiltration of inflammatory cells in OVA-sensitised mice. Despite receiving OVAchallenge, negative control (NC) mice were neither sensitised with OVA nor administered with drugtreatment. OVA-sensitised and challenged mice were administered 0.9% NaCl as an asthmatic Positivecontrol (PC). Other groups of OVA-sensitised and challenged mice were orally fed dexamethasone(DEX), standardised extracts at 10 mg/kg body weight for low dosage (GBE-L,) and 40 mg/kg body
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本文编号：2843695