基于Nrf2研究淫羊藿苷对6-OHDA诱导的神经损伤的保护作用及机制

发布时间：2020-10-17 00:54

　　 目的:观察淫羊藿苷(Icariin,ICA)对6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的神经元损伤的保护作用及其机制。方法:(1)在96孔板中接种PC12细胞(1×10~5/孔),24小时后加6-OHDA/ICA处理,MTT法筛选6-OHDA及ICA浓度。(2)确定6-OHDA及ICA浓度后,细胞随机分为空白组、6-OHDA组、6-OHDA+ICA低剂量组和6-OHDA+ICA高剂量组。ICA预处理24小时后,加入6-OHDA处理24小时,流式细胞仪检测细胞内ROS的含量及早期凋亡率;SOD试剂盒测定SOD水平;蛋白免疫印迹法检测氧化应激相关蛋白Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase 3、Cytochrome C的表达。(3)采用Nrf2-siRNA(40 nmol/L)转染PC12细胞,首先用蛋白免疫印迹法和Nrf2免疫荧光染色检验沉默/抑制效率,再用流式细胞仪检测细胞内ROS的含量及早期凋亡率;SOD试剂盒测定SOD水平;蛋白免疫印迹法检测氧化应激相关蛋白Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase 3、Cytochrome C的表达。结果:(1)MTT结果显示6-OHDA从100μM浓度开始具有细胞毒性作用,与空白组比较,模型组ROS及早期凋亡率明显增高,SOD表达明显降低,凋亡蛋白Bax/Bcl-2的比值、Caspase 3、Cytochrome C表达明显升高,Nrf2、Keap1及其下游蛋白HO-1、NQO1、GCLC表达升高;经ICA处理后,ROS明显降低,SOD表达明显升高,凋亡蛋白Bax/Bcl-2的比值,Caspase 3、Cytochrome C表达明显降低,Keap1表达降低,Nrf2及其下游蛋白HO-1、NQO1、GCLC表达进一步升高。(2)经Nrf2-siRNA处理PC12细胞后,再次加入ICA,ICA的神经保护作用消失,且ROS、SOD、氧化相关蛋白Keap1、核内Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase 3、Cytochrome C蛋白表达及早期凋亡率与模型组比较均无统计学意义。结论:ICA保护6-OHDA诱导的神经损伤部分通过调控Nrf2信号通路。
【学位单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

图 1. ICA 减轻 6-OHDA 诱导的神经损伤( x ±SEM, n=3). 与空白组比*P<0.05，与 6-OHDA 组#P<0.05.Fig.1 ICA protected against 6-OHDA-induced neuronal damage ( x±SEM, n=3). *P<0.05 vscontrol;#P<0.05 vs 6-OHDA2.2 ICA减轻6-OHDA诱导的细胞氧化应激如图 2 所示，与空白组比较，模型组 ROS 水平升高、SOD 活性降低；给予 IC后，ROS 释放量降低，SOD 升高（Fig. 2A& B）。此外，与模型组比较，ICA 处理后，胞浆 Nrf2 表达降低、胞核 Nrf2 表达增加（Fig. 2C）；Keap1 表达降低，Nrf2游蛋白 HO-1、NQO1、GCLC 的表达增高 （Fig. 2D）。

图 2. ICA减轻6-OHDA诱导的细胞氧化应激( x±SEM, n=3). 与空白组比*P<0.05，与6-OHDA比#P<0.05.Fig.2 ICA attenuated 6-OHDA-induced oxidative stress ( x±SEM, n=3). *P<0.05 vs control;#P<0.05 vs 6-OHDA2.3 ICA 对 6-OHDA 诱导的转染 Nrf2 的 PC12 细胞氧化应激的影响用 siRNA 沉默 Nrf2，荧光染色及 Western blot 结果均显示沉默率约为 70%（Fi3A）。沉默 Nrf2 后，与空白组比较，模型组 ROS 升高，SOD 表达降低；与 6-OHD组比较，给予 ICA 后，ROS 及 SOD 的表达均无改善（Fig. 3B & C）。Western bl检测结果显示，与空白组比较，6-OHDA 组 Keap1，HO-1， NQO1 表达增加；经 IC处理后，Keap1，HO-1， NQO1 表达与 6-OHDA 组无明显变化（Fig. 3D）。

图 3. ICA 对 6-OHDA 诱导的转染 Nrf2 的 PC12*P<0.05，与 6-OHDA 组比#P<0.05.Fig.3 Knockdown of Nrf2 abolished ICA-mediatvs control;#P<0.05 vs 6-OHDA2.4 ICA 对 6-OHDA 诱导的转染 Nr用 siRNA 沉默 Nrf2 后，MTT 结果护作用（Fig. 4A）。流式细胞仪检测模型Blot 结果显示模型组的凋亡基因 Bax/bc高；ICA 处理组 Nrf2 沉默后，细胞早期Caspase 3 的表达与 6-OHDA 组无显著差
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本文编号：2844030