沙棘提取物异鼠李素抑制树突状细胞成熟和迁移的作用机制研究

发布时间：2020-10-20 01:16

　　 研究背景树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是免疫抑制治疗的最主要靶点之一,是机体调节免疫系统最强的专职抗原递呈细胞,在调节固有免疫和适应性免疫、引发免疫反应和介导免疫耐受两方面发挥重要作用。研究表明,DCs广泛参与感染、肿瘤、自身免疫性疾病的发生发展,故研究DCs参与发病的原因及其作用机制对于治疗这些疾病有深厚的理论基础。异鼠李素(Isorhamnetin,Iso)是从中药沙棘中分离出的黄酮类化合物的主要活性成分,它发挥多种生物学作用,如抗氧化、抗炎、抗肿瘤、保护心血管等。Iso还被证实可以调节免疫反应,如通过抑制细胞因子的产生保护胶原诱导性关节炎。但是Iso在免疫系统上的细胞靶标及相应的作用机制还没有被阐明,Iso对DCs功能的影响尚无人报道。因此,本文首次研究了 Iso对骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow deprived DCs,BMDCs)成熟、递呈抗原、吞噬、迁移的影响。进一步发现针对DCs功能的靶向治疗药物,为自身免疫性疾病治疗提供理论基础和实用价值。目的1、探讨Iso对树突状细胞成熟、活化、抗原递呈、内吞的影响。2、探讨Iso对树突状细胞迁移功能的影响。方法本研究以BMDCs为研究对象,取小鼠骨髓分离培养、CD11c磁珠纯化BMDCs,首先采用凋亡坏死率和CCK8检测Iso对BMDCs的细胞毒性作用。取得安全浓度后采用流式细胞仪观察Iso对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激前后BMDCs的表面共刺激分子CD40,CD80,CD86和MHC Ⅱ类分子表达的影响;采用ELISA法检测细胞培养上清中细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-12p70和IL-10表达,采用Luminex法检测细胞培养上清中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α),IL-6和IL-1β的表达;采用混合淋巴细胞反应检测Iso对BMDCs刺激CD4+T细胞增殖情况的影响;采用流式细胞仪检测BMDCs吞噬大分子物质FITC-Dextran的能力;采用Transwell小室迁移实验观察Iso对BMDCs迁移能力的影响,同时采用流式细胞仪分析Iso对成熟BMDCs表面趋化因子受体(chemokine receptor,CCR)5,CCR7和CXCR4表达的影响,进一步明确Iso对BMDCs迁移的影响。结果本研究结果表明,体外培养的BMDCs在LPS刺激下表型和功能成熟,Iso干预后可显著抑制LPS诱导的BMDCs表面CD40、CD80和CD86表达,对MHCⅡ表达无影响;同样Iso干预后能显著抑制成熟BMDCs分泌细胞因子TNF-α,IL-6、IL-1β和IL-12p70,但是对BMDCs的吞噬功能和刺激T细胞增殖的能力没有影响。此外,Transwell实验发现Iso干预后可显著抑制成熟BMDCs迁移的能力,通过对其表面趋化因子受体检测,我们结果发现Iso主要通过抑制CCR7表达来阻止BMDCs迁移。综上,Iso可能是一种有效的免疫调节剂,它通过抑制BMDCs的成熟和迁移,有望成为预防及治疗慢性炎症性疾病、自身免疫性疾病的有效药物。结论1、Iso显著抑制体外BMDCs表型及功能成熟。2、Iso显著抑制体外BMDCs体外迁移。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R593.2
【部分图文】：

本实验同时采用ＣＣＫ８实验法检测细胞毒性，结果表明，与空白组相??比，当Ｉｓｏ的浓度时，ＯＤ值无显著差异（Ｐ＞０．０５），当Ｉｓｏ的浓度２１００??时，ＯＤ值明显减少，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。具体见图２－３。表明??Ｉｓ〇２的浓度１００?时细胞毒性明显，而１０?对细胞无毒性，本课题后续实??验中均以安全浓度１０｜ｉＭ的Ｉｓｏ作为各实验的干预浓度。??２３??

Ｉ?｜?Ｉ??图２－２不同浓度Ｉｓｏ对ＢＭＤＣｓ凋亡坏死的影响。当Ｉｓｏ的浓度对细胞凋亡坏死率无??显著差异（Ｐ＞０．０５），Ｉｓｏ的浓度２ｌ００｜ｉＭ时，凋亡坏死率显著升高（Ｐ＜０．０５）。＊＊ｐ＜０．０１；??ＮＳ，ｐ＞０．０５。??Ｆｉｇ．２－２?Ｔｈｅ?ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ?ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?Ｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ?ｏｎ?ＢＭＤＣｓ．?Ｐｕｒｉｆｉｅｄ?ＢＭＤＣｓ（＞９５％?ｆｏｒ??ＣＤｌｌｃ＋ｃｅｌｌｓ）?ｗｅｒｅ?ｔｒｅａｔｅｄ?ｗｉｔｈ?ｖａｒｉｏｕｓ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?Ｉｓｏ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｐｒｅｓｅｎｃｅ?ｏｒ?ａｂｓｅｎｃｅ?ｏｆ??ＬＰＳ（ｌ｜ｉｇ／ｍｌ），?ｔｈｅｎ?ｓｔａｉｎｅｄ?ｗｉｔｈ?Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ－ＦＩＴＣ／?Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ?Ｉｏｄｉｎｅ?Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ?Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?Ｋｉｔ．??Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ?ａｎｄ?ｎｅｃｒｏｔｉｃ?ｒａｔｅｓ?ｗｅｒｅ?ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ?ｂｙ?ｆｌｏｗ?ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．?Ｔｈｅ?Ｖａｌｕｅｓ?ａｒｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ?ａｓ??ｍｅａｎｓ土ＳＥＭ?ｏｆ?ｔｈｒｅｅ?ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．?＊＊?ｐ＜０．０１?ｗｅｒｅ?ｆｏｒ?ｔｈｅ?ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ?ｂｅｔｗｅｅｎ??Ｉｓｏ－ｔｒｅａｔｅｄ?ｖｅｒｓｕｓ?Ｉｓｏ?０｝ｉＭ，?ＮＳ，?ｐ＞０．０５．??３．２．２?ＣＣＫ８试齐ｌｊ盒检测Ｉｓｏ对细胞的毒性：为了更准确验证Ｉｓｏ对细胞（ＢＭＤＣｓ）??的毒性，本实验同时采用ＣＣＫ８实验法检测细胞毒性，结果表明，与空白组相??比

功能成熟的影响。第８天收获了纯化ＢＭＤＣｓ后，用ｌｕｇ／ｍＬ?ＬＰＳ刺激ＢＭＤＣｓ??成熟，再用１８〇１０＾刺激细胞，流式细胞术检测８＾＃潮砻妫埃埃福啊ⅲ０８６、??ＣＤ４０、ＭＨＣＩＩ（Ｉ－Ａｂ）的表达，以平均荧光强度（ＭＦＩ）表示检测结果，如图３－１??所示，我们的数据表明，与单纯组比较，单用Ｉｓｏ?（１〇ｈＭ）干预组对ＢＭＤＣｓ的??表面共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＭＨＣＩＩ（Ｉ－Ａｂ）的表达差异无统计学意义，??表明ｉＤＣｓ表面低表达共刺激分子、Ｉｓｏ对ｉＤＣｓ表面表型改变无影响。与单纯对??照组比较，ＬＰＳ刺激后ＢＭＤＣｓ表面ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＭＨＣＩＩ（Ｉ－Ａｂ）表达显??著升高（Ｐ＜０．０１），表明ＬＰＳ有效刺激ＢＭＤＣｓ活化成熟；Ｉｓｏ?（１０ｕＭ）对ＬＰＳ??催熟后的ＢＭＤＣｓ进行预干预后，ＢＭＤＣｓ表面共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０??的表达明显下降，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５），说明Ｉｓｏ通过抑制成熟ＢＭＤＣｓ??表面ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０表达来抑制ＢＭＤＣｓ成熟，而Ｉｓｏ对ＬＰＳ催熟后ＢＭＤＣｓ??的胃以叩－八？表达无影响⑶：＾见）。??３８??
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 ;Signaling mechanisms for regulation of chemotaxis[J];Cell Research;2005年01期

本文编号：2847988